Ler COA de Peptídeos: certificado de análise explicado
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Certificate of Analysis para péptidos: como ler e avaliar um COA?
No caso dos péptidos de investigação, é frequente fazer-se referência a um Certificate of Analysis, geralmente abreviado para COA. Este certificado de análise contém informações sobre a identidade, a composição ou a qualidade analítica de um produto específico ou de um lote de produção específico.
Um COA pode conter dados importantes, tais como:
-
o nome do péptido analisado;
-
o número do lote;
-
a pureza medida por HPLC;
-
a massa molecular teórica e medida;
-
os métodos analíticos utilizados;
-
a data em que a análise foi realizada.
No entanto, a existência de um COA não significa automaticamente que todos os aspetos da qualidade do péptido tenham sido analisados. O conteúdo do certificado deve ser avaliado. Entre outros aspetos, são importantes os métodos analíticos utilizados, a associação ao lote, a data do teste e a origem do relatório.
Por exemplo, um cromatograma com um pico principal elevado pode fornecer informações sobre a pureza cromatográfica, mas não prova automaticamente que a quantidade de péptido no frasco está correta. Um relatório padrão de HPLC ou de espectrometria de massa também não fornece informações sobre a esterilidade se não tiver sido realizado um teste específico para esse efeito.
Neste artigo, explicamos o que é um COA de péptidos, que informações pode conter e como interpretar corretamente diferentes resultados analíticos.
O que é um Certificate of Analysis?
Um Certificate of Analysis é um documento que regista os resultados analíticos de um produto, amostra ou lote de produção.
O documento é normalmente elaborado por:
-
o fabricante;
-
um laboratório interno de controlo de qualidade;
-
um laboratório externo especializado;
-
uma organização de testes independente.
Um COA pode ser utilizado para avaliar se as propriedades medidas correspondem a especificações do produto previamente definidas.
Dependendo do objetivo da investigação, o certificado pode conter informações sobre:
-
identidade;
-
pureza cromatográfica;
-
massa molecular;
-
teor de péptido;
-
teor de água;
-
solventes residuais;
-
endotoxinas;
-
qualidade microbiológica.
Nem todos os COA de péptidos incluem todas estas análises.
Por isso, é sempre necessário verificar o que foi efetivamente testado.
Porque é importante um COA para péptidos de investigação?
Os péptidos não podem ser avaliados de forma fiável apenas com base na aparência.
Uma estrutura branca liofilizada não permite determinar:
-
qual é o péptido presente;
-
qual é a quantidade de péptido presente;
-
qual é a pureza química;
-
se estão presentes produtos de degradação;
-
se o material foi corretamente identificado.
Os testes analíticos podem fornecer informações que não estão disponíveis através da inspeção visual.
Um COA apoia, entre outras coisas:
-
controlo de qualidade;
-
rastreabilidade do lote;
-
comparação entre lotes de produção;
-
documentação de dados de investigação;
-
avaliação das especificações do produto;
-
reprodutibilidade das experiências.
O valor de um COA depende da qualidade e da completude da análise subjacente.
Que dados básicos devem constar de um COA de péptido?
Um certificado de análise útil deve, de preferência, conter informações suficientes para identificar a amostra analisada.
Os dados importantes são:
Nome do produto
O nome do péptido analisado deve ser indicado claramente.
De preferência, devem também ser incluídos dados de identificação adicionais, tais como:
-
sequência de aminoácidos;
-
fórmula molecular;
-
número CAS;
-
massa molecular teórica.
Nem todos os péptidos têm uma única designação de produto universalmente utilizada. Por isso, informações moleculares adicionais podem ajudar a evitar confusões.
Número de lote
O número de lote associa o relatório de análise a um lote de produção específico.
O número indicado no COA deve coincidir com o número presente em:
-
o vial;
-
o rótulo;
-
a embalagem;
-
a documentação interna do produto.
Quando os números de lote não coincidem, não é possível determinar de forma fiável se o certificado diz respeito ao produto recebido.
Data da análise
A data da análise indica quando a amostra foi analisada.
Esta data é importante porque um resultado analítico descreve o estado da amostra num determinado momento.
Após a análise, o armazenamento, a temperatura, a humidade, o oxigénio e o transporte podem influenciar a estabilidade.
Método analítico utilizado
Uma percentagem sem o método analítico oferece pouco contexto.
Por isso, o COA deve indicar claramente qual foi a técnica utilizada, por exemplo:
-
RP-HPLC;
-
LC-MS;
-
ESI-MS;
-
MALDI-TOF;
-
análise de aminoácidos;
-
análise da humidade pelo método de Karl Fischer.
Cada método analisa características de qualidade diferentes.
O que significa a pureza por HPLC num COA?
HPLC significa High-Performance Liquid Chromatography.
Com esta técnica, os componentes de uma amostra dissolvida são separados cromatograficamente uns dos outros.
O resultado é apresentado num cromatograma.
Um cromatograma contém normalmente:
-
um eixo temporal horizontal;
-
uma resposta vertical do detetor;
-
um pico principal;
-
eventuais picos secundários menores.
Quando um COA, por exemplo, indica uma pureza por HPLC de 99%, isso significa geralmente que cerca de 99% do sinal cromatográfico integrado foi atribuído ao pico principal.
Isto não significa automaticamente que 99% do peso total do vial seja constituído pelo péptido pretendido.
Podem estar presentes outros componentes, tais como:
-
água;
-
sais;
-
contra-íons;
-
excipientes;
-
componentes que não são medidos pelo método utilizado.
A pureza por HPLC e o teor real de péptido são, por isso, parâmetros de qualidade diferentes.
Como ler um cromatograma de HPLC?
Ao avaliar um cromatograma, podem ser relevantes vários elementos.
Tempo de retenção
O tempo de retenção é o tempo de que um componente necessita para alcançar o detetor.
Este tempo é influenciado por:
-
o tipo de coluna;
-
a fase móvel;
-
o caudal;
-
a temperatura;
-
as propriedades do péptido.
Um tempo de retenção correspondente pode apoiar a identificação quando é utilizado um padrão de referência adequado.
No entanto, o tempo de retenção, por si só, não prova definitivamente que o péptido correto está presente.
Pico principal
O pico maior é geralmente interpretado como o principal componente peptídico.
A identidade deste pico deve, de preferência, ser apoiada por dados analíticos adicionais.
Picos secundários
Os picos menores podem ter diferentes causas.
As possíveis explicações são:
-
variantes relacionadas com a síntese;
-
cadeias peptídicas encurtadas;
-
produtos de oxidação;
-
produtos de degradação;
-
outros componentes detetados.
Nem todo o pico pequeno constitui automaticamente um problema de qualidade relevante. A identidade e a quantidade devem ser investigadas separadamente.
Área do pico
A área sob um pico é utilizada para o cálculo relativo dos componentes cromatográficos.
O resultado pode ser influenciado por:
-
definições de integração;
-
comprimento de onda de deteção;
-
concentração da amostra;
-
método de análise.
Por isso, uma percentagem deve ser sempre interpretada no contexto do método utilizado.
O que significa a espectrometria de massa num COA?
A espectrometria de massa é utilizada para medir a razão massa-carga de moléculas ionizadas.
Na análise de péptidos, a massa molecular medida é comparada com a massa teoricamente esperada.
Um COA pode, por exemplo, indicar:
-
massa teórica: 3.250,7 Da;
-
massa medida: 3.250,9 Da.
Uma boa correspondência apoia a identificação molecular.
No entanto, a espectrometria de massa não fornece automaticamente informações sobre:
-
pureza cromatográfica;
-
quantidade exata de péptido;
-
esterilidade;
-
endotoxinas;
-
atividade biológica.
Por isso, a HPLC e a espectrometria de massa são frequentemente combinadas.
Por que motivo são a HPLC e a espectrometria de massa complementares?
A HPLC e a espectrometria de massa respondem a diferentes questões analíticas.
A HPLC analisa principalmente:
-
quantos componentes cromatográficos são visíveis;
-
que proporção relativa corresponde ao pico principal;
-
se estão presentes picos secundários menores.
A espectrometria de massa analisa principalmente:
-
que massa molecular é medida;
-
ou se esta massa corresponde ao péptido esperado;
-
ou se determinadas modificações químicas são visíveis.
Uma pureza elevada por HPLC, sem análise da identidade, não comprova totalmente que o pico principal representa o péptido correto.
Uma massa molecular correspondente, sem análise da pureza, não proporciona uma imagem completa da composição relativa.
Por conseguinte, a combinação fornece mais informação do que qualquer método isolado.
O que é o teor de péptido?
O teor de péptido descreve a quantidade de péptido efetivamente presente em relação ao material total.
Isto é por vezes designado por:
-
teor de péptido;
-
doseamento do péptido;
-
teor líquido de péptido.
O teor de péptido pode diferir da pureza por HPLC.
Um produto liofilizado pode conter, além do péptido:
-
água ligada;
-
humidade residual;
-
contra-íons;
-
sais;
-
excipientes.
Por isso, um resultado de HPLC de 99% não significa automaticamente que 99% da massa seca total seja constituída por péptido.
Para uma determinação quantitativa, podem ser necessários métodos adicionais.
O que é a análise de aminoácidos?
A análise de aminoácidos pode ser utilizada para obter informações sobre a composição de aminoácidos ou a quantidade de péptido.
Durante a análise, o péptido é geralmente decomposto em aminoácidos individuais.
Em seguida, estes são medidos.
A análise de aminoácidos pode contribuir para:
-
quantificação;
-
controlo da composição de aminoácidos;
-
comparação com a sequência teórica.
O método tem limitações.
Determinados aminoácidos podem sofrer alterações ou perder-se parcialmente durante a hidrólise.
Por isso, os resultados devem ser interpretados por especialistas.
O que significa teor de água?
Após a liofilização, pode permanecer uma pequena quantidade de humidade residual.
O teor de água pode influenciar:
-
estabilidade;
-
mobilidade molecular;
-
estrutura física;
-
velocidade de degradação.
Um método frequentemente utilizado para a análise da humidade é a titulação de Karl Fischer.
Esta técnica pode ser utilizada especificamente para determinar a quantidade de água.
Um baixo teor de humidade não significa automaticamente que a qualidade global seja ideal. A quantidade desejada de humidade residual pode variar consoante a formulação do péptido.
O que são contra-íons?
Durante a produção e a purificação, os péptidos podem estar presentes sob a forma de sal.
Os contra-íons mais comuns são:
-
acetato;
-
trifluoroacetato;
-
cloreto.
Estes iões podem contribuir para a massa total do material liofilizado.
A quantidade de contra-íons pode depender de:
-
síntese;
-
método de purificação;
-
troca iónica;
-
formulação.
Os contra-íons nem sempre são apresentados numa percentagem padrão de pureza por HPLC.
O que significa um teste de esterilidade?
Um teste de esterilidade analisa se são detetados microrganismos viáveis nas condições de teste aplicadas.
Trata-se de uma análise microbiológica independente.
Um resultado de HPLC ou MS não comprova a esterilidade.
Quando um COA indica exclusivamente:
-
pureza por HPLC;
-
massa molecular;
nesse caso, não é possível tirar qualquer conclusão sobre a esterilidade.
O ensaio de esterilidade requer métodos específicos, condições controladas e um protocolo de teste adequado.
O que é um teste de endotoxinas?
As endotoxinas são componentes da membrana externa de determinadas bactérias Gram-negativas.
A análise de endotoxinas é uma análise de qualidade independente.
Os métodos mais utilizados são:
-
teste LAL;
-
teste do fator C recombinante.
Os resultados podem ser apresentados em unidades de endotoxinas, por exemplo:
UE por frasco
ou:
UE por miligrama
Um baixo valor de endotoxinas não é o mesmo que esterilidade.
Uma amostra pode não apresentar crescimento microbiológico detetável e, ainda assim, conter endotoxinas. Inversamente, um teste de endotoxinas não substitui um ensaio de esterilidade.
O que significa “aprovado” num COA?
Alguns certificados indicam, para cada teste:
-
aprovado;
-
está conforme;
-
cumpre;
-
aprovado.
Estes termos significam geralmente que o resultado se encontra dentro de uma especificação previamente definida.
Para avaliar corretamente o significado, é necessário esclarecer:
-
qual foi a especificação utilizada;
-
qual era o valor-limite;
-
qual foi o método aplicado;
-
qual foi o resultado medido.
Apenas a palavra “aprovado”, sem um valor medido ou uma especificação, oferece transparência limitada.
O que é uma especificação do produto?
Uma especificação do produto descreve critérios de qualidade previamente definidos.
São exemplos:
-
pureza por HPLC ≥98%;
-
massa molecular dentro de uma determinada tolerância;
-
teor de humidade abaixo de um limite estabelecido;
-
aspeto conforme a descrição.
Um resultado analítico é comparado com estes critérios.
Quando um resultado se encontra dentro da especificação, o lote pode ser aprovado para a característica analisada.
Uma especificação do produto deve ser adequada a:
-
o produto;
-
o método de análise;
-
o objetivo da investigação.
Qual é a diferença entre um COA interno e um COA independente?
Um COA interno é elaborado com base em análises realizadas pelo produtor ou por um laboratório diretamente envolvido na produção.
Um COA independente é elaborado por um laboratório externo.
Uma análise independente pode proporcionar uma verificação adicional.
O valor depende de:
-
independência;
-
qualidade do laboratório;
-
método de análise utilizado;
-
identificação da amostra;
-
associação ao lote;
-
integridade do relatório.
Apenas um logótipo externo não prova que toda a cadeia de custódia tenha sido verificada de forma independente.
A seleção e o envio da amostra também são relevantes.
O que é a cadeia de custódia?
A cadeia de custódia descreve o percurso documentado de uma amostra.
Pode ser registado:
-
quem selecionou a amostra;
-
quando foi embalada;
-
quem a enviou;
-
quando o laboratório a recebeu;
-
como foi armazenada;
-
quando a análise foi realizada.
Uma cadeia de custódia clara reduz a incerteza sobre:
-
troca;
-
origem;
-
identidade da amostra.
Numa análise independente, esta documentação pode reforçar a verificabilidade.
Como reconhecer um COA limitado?
Um COA oferece menos verificabilidade quando faltam dados importantes.
Os aspetos a ter em conta incluem:
-
ausência do número do lote;
-
ausência da data da análise;
-
ausência do nome do laboratório;
-
ausência do método analítico utilizado;
-
apenas uma percentagem de pureza;
-
ausência de cromatograma;
-
ausência de espectro de massa;
-
dados ilegíveis;
-
número do lote que não corresponde ao frasco.
A ausência de um único elemento não significa automaticamente que uma análise não seja fiável.
No entanto, a integridade determina quantas conclusões podem ser retiradas do documento.
Um COA pode ser falsificado?
Os documentos digitais e as imagens podem ser alterados.
Por isso, a possibilidade de verificação é importante.
Os possíveis métodos de verificação incluem:
-
verificar os números dos lotes;
-
comparar com o frasco físico;
-
verificar através do laboratório;
-
verificar os números dos relatórios;
-
utilizar um portal laboratorial;
-
verificar códigos de verificação digitais.
Um design profissional não constitui, por si só, prova de fiabilidade analítica.
Os dados de teste subjacentes são mais importantes do que o aspeto visual.
Por que motivo cada lote deve ser avaliado separadamente?
Os processos de produção podem apresentar pequenas diferenças entre lotes.
As variáveis possíveis incluem:
-
matérias-primas;
-
eficiência da síntese;
-
processo de purificação;
-
liofilização;
-
humidade residual;
-
duração do armazenamento.
Por conseguinte, uma análise de um lote mais antigo não pode ser automaticamente utilizada como prova de um lote novo.
A análise específica do lote apoia:
-
rastreabilidade;
-
controlo de qualidade;
-
comparação entre lotes de produção;
-
investigação de desvios.
O número do lote no COA deve corresponder ao produto a que o certificado diz respeito.
Um COA pode comprovar o prazo de validade?
Não de forma autónoma.
Uma análise única descreve o estado de uma amostra num momento específico.
Para fundamentar a estabilidade a longo prazo, são necessários dados adicionais.
Um estudo de estabilidade pode incluir:
-
vários momentos de medição;
-
temperaturas de armazenamento controladas;
-
análise da humidade;
-
monitorização por HPLC;
-
análise dos produtos de degradação;
-
avaliação da embalagem.
Uma elevada pureza na data de produção não garante automaticamente a mesma qualidade após um armazenamento prolongado.
Limitações científicas
Um COA é um documento de qualidade importante, mas não constitui uma garantia completa.
A interpretação é limitada por:
-
os métodos analíticos utilizados;
-
a qualidade da preparação da amostra;
-
a representatividade da amostra;
-
a validação do método;
-
a integridade do relatório;
-
o período entre a análise e a utilização.
Um COA comprova apenas o que foi efetivamente analisado através de métodos adequados.
As propriedades não testadas não podem ser deduzidas de outros resultados.
Por exemplo, um teste de HPLC não comprova a esterilidade, e um resultado de espectrometria de massa não comprova o conteúdo exato do frasco.
Resumo
Um Certificate of Analysis contém informação analítica sobre um produto para investigação ou sobre um lote de produção específico.
Os elementos importantes incluem:
-
identidade do produto;
-
número de lote ou de série;
-
data da análise;
-
métodos de análise utilizados;
-
resultado de HPLC;
-
resultado da espectrometria de massa;
-
especificações do produto.
Ao fazer a avaliação, é importante verificar:
-
O número de lote corresponde ao do frasco?
-
É claro qual foi o laboratório que realizou a análise?
-
A data da análise está indicada?
-
Os métodos utilizados estão descritos?
-
Estão disponíveis cromatogramas ou espectros?
-
Os valores de medição e as especificações são apresentados de forma clara?
-
São tiradas conclusões apenas sobre propriedades que foram efetivamente testadas?
Um COA promove a transparência e o controlo de qualidade, mas deve ser sempre interpretado quanto ao conteúdo e em conjunto com outros dados do produto.
Aviso de investigação
Os péptidos para investigação da Peptidera são disponibilizados exclusivamente para Research Use Only (RUO) e destinam-se à investigação laboratorial e a aplicações analíticas.
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Certificado de análise específico do lote de péptidos, com cromatograma de HPLC e dados de espectrometria de massa, junto a frascos de péptidos para investigação