Peptide-oxidação: causas e análise explicadas

Oxidação de péptidos: causas, aminoácidos sensíveis e análise

A oxidação de péptidos é uma questão importante de qualidade na investigação de péptidos. Alguns aminoácidos numa cadeia peptídica podem sofrer alterações químicas sob a influência do oxigénio, da luz, da temperatura, de iões metálicos ou das condições de armazenamento.

A oxidação pode afetar:

• massa molecular;
• pureza química;
• estrutura;
• solubilidade;
• estabilidade;
• reprodutibilidade da investigação.

Nem todos os péptidos são igualmente sensíveis à oxidação. A sensibilidade depende sobretudo da sequência de aminoácidos, da formulação, da embalagem e das condições de armazenamento.

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O que é a oxidação de péptidos?

A oxidação é uma reação química na qual uma molécula perde eletrões ou reage com espécies reativas de oxigénio.

Nos péptidos, resíduos específicos de aminoácidos podem sofrer alterações. Isto pode resultar numa forma molecular diferente da originalmente pretendida.

A oxidação pode ocorrer durante:

• síntese de péptidos;
• purificação;
• liofilização;
• armazenamento;
• transporte;
• preparação de amostras;
• exposição à luz ou ao oxigénio.

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Que aminoácidos são sensíveis à oxidação?

Nem todos os aminoácidos reagem com a mesma facilidade.

Sobretudo estes resíduos podem ser sensíveis à oxidação:

Metionina

A metionina é um dos aminoácidos mais conhecidos pela sua sensibilidade à oxidação. A oxidação pode levar à formação de metionina sulfóxido.

Isto provoca geralmente um aumento de massa de aproximadamente +16 Da.

Cisteína

A cisteína contém um grupo tiol. Este grupo pode estar envolvido em:

• formação de pontes dissulfureto;
• modificações oxidativas;
• alterações estruturais.

Nos péptidos com cisteína, a formação correta de pontes dissulfureto é frequentemente importante para a estrutura molecular.

Triptofano

O triptofano pode ser sensível a reações oxidativas e fotoquímicas.

A luz, o oxigénio e determinados componentes reativos podem contribuir para alterações.

Tirosina

A tirosina pode sofrer modificações oxidativas em determinadas condições.

Histidina

A histidina também pode ser sensível a processos oxidativos, dependendo do ambiente molecular.

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O que causa a oxidação?

As causas importantes são:

Oxigénio

O oxigénio presente no ambiente pode contribuir para reações oxidativas. O grau depende do péptido e das condições de armazenamento.

Luz

A luz UV e a luz visível intensa podem acelerar reações fotoquímicas.

Por isso, as substâncias fotossensíveis são frequentemente protegidas da luz direta.

Temperatura

Temperaturas mais elevadas aceleram muitos processos químicos.

A oxidação também pode ocorrer mais rapidamente após uma exposição prolongada ao calor.

Iões metálicos

Vestígios de iões metálicos podem catalisar reações de oxidação.

São exemplos o ferro e o cobre.

pH e humidade

Em solução, o pH, a atividade da água e os componentes do tampão podem influenciar a velocidade de oxidação.

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Oxidação na forma liofilizada

A liofilização pode melhorar a estabilidade dos péptidos, uma vez que a água é em grande parte removida.

Ainda assim, a liofilização não evita completamente a oxidação.

Também podem ocorrer alterações oxidativas no estado seco, sobretudo em caso de:

• temperatura elevada;
• exposição ao oxigénio;
• exposição à luz;
• barreira de embalagem insuficiente;
• teor de humidade residual elevado.

Por isso, a embalagem adequada continua a ser importante.

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Oxidação após a dissolução

Quando um péptido liofilizado é novamente dissolvido, o ambiente de estabilidade altera-se.

Em solução, as moléculas podem mover-se mais facilmente. Consequentemente, os processos de oxidação podem ocorrer mais rapidamente.

Fatores que se tornam importantes:

• tipo de solvente;
• pH;
• oxigénio na solução;
• exposição à luz;
• temperatuur;
• tempo de contacto;
• presença de iões metálicos.

Por isso, a estabilidade em solução deve ser avaliada separadamente.

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Como é estudada analiticamente a oxidação?

A oxidação pode ser estudada através de várias técnicas.

HPLC

A HPLC pode mostrar picos novos ou deslocados quando se formam produtos de oxidação.

Um produto de oxidação pode ter um tempo de retenção diferente do péptido original.

LC-MS

A LC-MS pode ajudar a detetar diferenças de massa.

Por exemplo, uma oxidação comum da metionina provoca um aumento de massa de aproximadamente +16 Da.

MS/MS

A espectrometria de massa em tandem pode ajudar a determinar em que ponto da cadeia peptídica se encontra a modificação.

Estudo de estabilidade

A oxidação pode ser acompanhada ao longo do tempo, por exemplo, a diferentes temperaturas e em diferentes condições de armazenamento.

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Porque é que a oxidação é importante para o controlo da qualidade?

A oxidação pode originar variantes de péptidos que não são idênticas à sequência pretendida.

Isso pode influenciar:

• reprodutibilidade analítica;
• comparação entre lotes;
• interpretação dos resultados da investigação;
• perfil de estabilidade;
• percentagem de pureza.

Por isso, o controlo da oxidação é importante no caso de péptidos que contêm aminoácidos suscetíveis à oxidação.

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Oxidação e COA

Um COA padrão nem sempre indica especificamente os produtos de oxidação.

Por isso, preste atenção:

• HPLC-chromatogram;
• LC-MS-resultaat;
• gemeten massa;
• eventuele nevenpieken;
• batchnummer;
• analysedatum;
• stabiliteitsinformatie.

Een COA met alleen “99% zuiverheid” geeft beperkte informatie over welke nevencomponenten aanwezig zijn.

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Preventieve kwaliteitsmaatregelen

Binnen de laboratorium- en productiekwaliteit kunnen oxidatierisico’s worden beperkt door:

• bescherming tegen licht;
• geschikte opslagtemperatuur;
• beperking van zuurstofblootstelling;
• correcte lyofilisatie;
• geschikte flaconafdichting;
• vermijden van metaalverontreiniging;
• batchspecifieke analyse;
• stabiliteitsonderzoek.

Geen enkele maatregel sluit oxidatie volledig uit, maar samen verkleinen ze het risico.

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Wetenschappelijke beperkingen

De oxidatiegevoeligheid verschilt per peptide.

Resultaten van één peptide kunnen niet automatisch worden toegepast op een ander peptide.

Daarnaast kan een oxidatieproduct:

• moeilijk te scheiden zijn;
• in lage concentraties aanwezig zijn;
• overlappen met andere signalen;
• alleen zichtbaar worden met specifieke analysemethoden.

Daarom is methodekeuze belangrijk.

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Samenvatting

Peptide-oxidatie is een chemisch degradatieproces dat vooral relevant is bij aminozuren zoals methionine, cysteïne, tryptofaan, tyrosine en histidine.

Oxidatie kan worden beïnvloed door:

• zuurstof;
• licht;
• temperatuur;
• vocht;
• metaalionen;
• pH;
• opslagcondities.

Analysetechnieken zoals HPLC, LC-MS en MS/MS kunnen helpen om oxidatieproducten te detecteren en te karakteriseren.

Voor betrouwbare peptidekwaliteit moeten oxidatie, zuiverheid, identiteit, peptidegehalte, verpakking en stabiliteit gezamenlijk worden beoordeeld.

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Onderzoeksdisclaimer

De onderzoekspeptiden van Peptidera worden uitsluitend aangeboden voor Research Use Only (RUO) en zijn bestemd voor laboratoriumonderzoek en analytische toepassingen.

Niet bedoeld voor menselijke of dierlijke consumptie, diagnostisch gebruik, therapeutische toepassing of zelftoediening.

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Categorie:
Peptidekennis & kwaliteitscontrole

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Naam van afbeeldingsbestand:
PB-0235-peptide-oxidatie-analyse.jpg

Alt-tekst:
LC-MS-analyse van peptide-oxidatie met oxidatiegevoelige aminozuren en onderzoekspeptideflacons in een modern laboratorium.