Oxidação de peptídeos: causas, aminoácidos sensíveis e análise

A oxidação de peptídeos é um tema importante de qualidade na pesquisa de peptídeos. Alguns aminoácidos numa cadeia peptídica podem mudar quimicamente sob influência de oxigénio, luz, temperatura, iões metálicos ou condições de armazenamento.

A oxidação pode afetar:

• massa molecular;
• pureza química;
• estrutura;
• solubilidade;
• estabilidade;
• reprodutibilidade da pesquisa.

Nem todos os peptídeos são igualmente sensíveis à oxidação. A sensibilidade depende principalmente da sequência de aminoácidos, formulação, embalagem e condições de armazenamento.

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O que é a oxidação de peptídeos?

Oxidação é uma reação química em que uma molécula perde eletrões ou reage com compostos reativos de oxigénio.

Em peptídeos, resíduos específicos de aminoácidos podem mudar. Isto pode levar a uma forma molecular diferente da originalmente pretendida.

A oxidação pode ocorrer durante:

• síntese de peptídeos;
• purificação;
• liofilização;
• armazenamento;
• transporte;
• preparação de amostras;
• exposição à luz ou oxigénio.

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Quais aminoácidos são sensíveis à oxidação?

Nem todos os aminoácidos reagem com a mesma facilidade.

Principalmente estes resíduos podem ser sensíveis à oxidação:

Metionina

A metionina é um dos aminoácidos mais conhecidos por ser sensível à oxidação. A oxidação pode levar à metionina sulfoxida.

Isto geralmente causa um aumento de massa de cerca de +16 Da.

Cisteína

A cisteína contém um grupo tiol. Este grupo pode estar envolvido em:

• formação de pontes dissulfeto;
• modificações oxidativas;
• alterações estruturais.

Em peptídeos com cisteína, a formação correta de dissulfetos é frequentemente importante para a estrutura molecular.

Triptofano

Triptofano pode ser sensível a reações oxidativas e fotoquímicas.

Luz, oxigénio e certos componentes reativos podem contribuir para alterações.

Tirosina

A tirosina pode sofrer modificações oxidativas em certas condições.

Histidina

A histidina também pode ser sensível a processos oxidativos, dependendo do ambiente molecular.

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Como ocorre a oxidação?

As causas principais são:

Oxigénio

O oxigénio no ambiente pode contribuir para reações oxidativas. O grau depende do peptídeo e das condições de armazenamento.

Luz

Luz UV e luz visível intensa podem acelerar reações fotoquímicas.

Por isso, substâncias sensíveis à luz são frequentemente protegidas contra luz direta.

Temperatura

Temperaturas mais elevadas aceleram muitos processos químicos.

A oxidação também pode acelerar com exposição prolongada ao calor.

Iões metálicos

Traços de iões metálicos podem catalisar reações de oxidação.

Exemplos são ferro e cobre.

pH e humidade

Em solução, o pH, a atividade da água e os componentes do tampão podem influenciar a velocidade da oxidação.

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Oxidação na forma liofilizada

A liofilização pode melhorar a estabilidade dos peptídeos ao remover grande parte da água.

No entanto, a liofilização não previne completamente a oxidação.

Mesmo em estado seco, podem ocorrer alterações oxidativas, especialmente em:

• temperatura elevada;
• exposição ao oxigénio;
• exposição à luz;
• barreira de embalagem insuficiente;
• humidade residual aumentada.

Por isso, a embalagem correta continua a ser importante.

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Oxidação após dissolução

Quando um peptídeo liofilizado é dissolvido novamente, o ambiente de estabilidade muda.

Em solução, as moléculas movem-se mais facilmente. Por isso, os processos de oxidação podem ocorrer mais rapidamente.

Factores importantes nestas condições:

• tipo de solvente;
• pH;
• oxigénio na solução;
• exposição à luz;
• temperatura;
• tempo de contacto;
• presença de iões metálicos.

A estabilidade em solução deve ser avaliada separadamente.

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Como é que a oxidação é analisada?

A oxidação pode ser investigada com várias técnicas.

HPLC

HPLC pode mostrar picos novos ou deslocados quando surgem produtos de oxidação.

Um produto de oxidação pode ter um tempo de retenção diferente do peptídeo original.

LC-MS

LC-MS pode ajudar a detetar diferenças de massa.

Uma oxidação comum da metionina, por exemplo, dá um aumento de massa de cerca de +16 Da.

MS/MS

A espectrometria de massa em tandem pode ajudar a determinar onde na cadeia peptídica ocorre a modificação.

Estudo de estabilidade

A oxidação pode ser monitorizada ao longo do tempo, por exemplo, a diferentes temperaturas e condições de armazenamento.

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Por que a oxidação é importante para o controlo de qualidade?

A oxidação pode causar variantes de peptídeos que não são idênticas à sequência pretendida.

Isto pode influenciar:

• reprodutibilidade analítica;
• comparação de lotes;
• interpretação dos resultados da investigação;
• perfil de estabilidade;
• percentagem de pureza.

Por isso, o controlo da oxidação é importante em peptídeos que contêm aminoácidos sensíveis à oxidação.

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Oxidação e COA

Um COA padrão nem sempre menciona especificamente produtos de oxidação.

Preste atenção:

• Cromatograma HPLC;
• resultado LC-MS;
• massa medida;
• picos secundários eventuais;
• número do lote;
• data da análise;
• informação de estabilidade.

Um COA com apenas “99% de pureza” fornece informação limitada sobre quais os componentes secundários presentes.

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Medidas preventivas de qualidade

No controlo de qualidade laboratorial e de produção, os riscos de oxidação podem ser reduzidos por:

• proteção contra a luz;
• temperatura de armazenamento adequada;
• limitar a exposição ao oxigénio;
• liofilização correta;
• fecho adequado do frasco;
• evitar contaminação metálica;
• análise específica de lote;
• estudo de estabilidade.

Nenhuma medida elimina completamente a oxidação, mas em conjunto reduzem o risco.

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Limitações científicas

A sensibilidade à oxidação varia consoante o peptídeo.

Os resultados de um peptídeo não podem ser automaticamente aplicados a outro peptídeo.

Além disso, um produto de oxidação pode:

• difícil de separar;
• presença baixa;
• sobreposição com outros sinais;
• só visível com métodos analíticos específicos.

Por isso, a escolha do método é importante.

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Resumo

A oxidação de peptídeos é um processo de degradação química especialmente relevante em aminoácidos como metionina, cisteína, triptofano, tirosina e histidina.

A oxidação pode ser influenciada por:

• oxigénio;
• luz;
• temperatura;
• humidade;
• íons metálicos;
• pH;
• condições de armazenamento.

Técnicas de análise como HPLC, LC-MS e MS/MS podem ajudar a detetar e caracterizar produtos de oxidação.

Para garantir a qualidade fiável dos peptídeos, devem ser avaliados em conjunto oxidação, pureza, identidade, teor de peptídeo, embalagem e estabilidade.

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Aviso de investigação

Os peptídeos de investigação da Peptidera são oferecidos exclusivamente para Research Use Only (RUO) e destinam-se a investigação laboratorial e aplicações analíticas.

Não destinado ao consumo humano ou animal, uso diagnóstico, aplicação terapêutica ou autoadministração.

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Categoria:
Conhecimento sobre peptídeos & controlo de qualidade

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Nome do ficheiro da imagem:
PB-0235-análise-oxidação-peptídeos.jpg

Texto alternativo:
Análise LC-MS de oxidação de peptídeos com aminoácidos sensíveis à oxidação e frascos de peptídeos de investigação num laboratório moderno.