Padrões de referência peptídicos explicados
Peptide-referentiestandaarden: waarom analytische vergelijking belangrijk is
Bij de kwaliteitsanalyse van onderzoekspeptiden worden vaak technieken gebruikt zoals:
- HPLC;
- LC-MS;
- ensaio do peptídeo;
- análise de aminoácidos;
- UV-spectrofotometrie.
Deze instrumenten produceren meetgegevens, maar een detectorsignaal of chromatografische piek heeft niet automatisch een exacte betekenis.
Om een onbekend monster betrouwbaar te identificeren of kwantificeren, kan het worden vergeleken met een materiaal waarvan relevante eigenschappen al zorgvuldig zijn vastgesteld.
Zo’n materiaal wordt een referentiestandaard genoemd.
Een goed gekarakteriseerde peptide-referentiestandaard kan worden gebruikt voor:
- identificação;
- comparação dos tempos de retenção;
- quantificação;
- calibração;
- beoordeling van HPLC-methoden;
- onderzoek naar onzuiverheden;
- analyse van degradatieproducten;
- ondersteuning van meettraceerbaarheid.
De kwaliteit van een analytisch resultaat hangt daardoor niet alleen af van het laboratoriuminstrument. Ook de identiteit, zuiverheid, het peptidegehalte, de opslag en de documentatie van de gebruikte referentiestandaard zijn belangrijk.
Een referentiestandaard is bovendien niet automatisch hetzelfde als een willekeurig monster met een hoog HPLC-percentage. Voor kwantitatief gebruik moet duidelijk zijn hoeveel werkelijke peptide aanwezig is en welke niet-peptidecomponenten bijdragen aan de totale massa.
In deze blog bespreken we wat peptide-referentiestandaarden zijn, hoe primaire en secundaire standaarden verschillen en waarom analytische vergelijking belangrijk is voor betrouwbare peptideanalyse.
Wat is een peptide-referentiestandaard?
Een peptide-referentiestandaard is een zorgvuldig gekarakteriseerd materiaal dat als vergelijkingsbasis wordt gebruikt tijdens laboratoriumanalyse.
Afhankelijk van het onderzoeksdoel kunnen eigenschappen zijn vastgesteld zoals:
- aminozuursequentie;
- massa molecular;
- identidade;
- pureza por HPLC;
- teor de peptídeo;
- teor de água;
- teor de contra-iões;
- aanwezigheid van relevante onzuiverheden;
- opslagstabiliteit.
De standaard kan vervolgens worden gebruikt om een onbekend monster analytisch te vergelijken.
De benodigde karakterisering hangt af van de toepassing.
Een standaard voor identificatie hoeft niet altijd aan exact dezelfde eisen te voldoen als een standaard voor kwantitatieve assay.
Waarom is analytische vergelijking nodig?
Een laboratoriuminstrument meet een fysisch of chemisch signaal.
São exemplos:
- UV-absorptie;
- fluorescentie;
- chromatografische piekoppervlakte;
- massa-ladingverhouding;
- ionintensiteit.
Een signaal is niet automatisch gelijk aan een exacte hoeveelheid peptide.
Daarvoor is een betrouwbare relatie nodig tussen:
- bekende hoeveelheid;
- gemeten signaal;
- onbekend monster.
Een referentiestandaard kan helpen deze relatie vast te stellen.
Een eenvoudig voorbeeld
Stel dat een laboratorium de hoeveelheid van een peptide met kwantitatieve HPLC wil bepalen.
Het laboratorium bereidt verschillende oplossingen van een gekarakteriseerde referentiestandaard:
- 0,1 mg/ml;
- 0,25 mg/ml;
- 0,5 mg/ml;
- 0,75 mg/ml;
- 1,0 mg/ml.
Elke oplossing wordt geanalyseerd.
Representam-se as áreas dos picos medidos em função das concentrações conhecidas.
Obtém-se assim uma curva de calibração.
Em seguida, mede-se a amostra desconhecida.
A concentração pode ser calculada comparando o sinal da amostra com a curva de calibração.
A fiabilidade deste cálculo depende, entre outros fatores, de:
- qualidade do padrão de referência;
- cálculo correto da concentração;
- pesagem precisa;
- pipetagem precisa;
- linearidade do método;
- estabilidade das soluções.
O que é um padrão de referência primário?
Um padrão de referência primário é um material cujas propriedades relevantes foram amplamente determinadas.
O padrão pode ser caracterizado através de várias técnicas analíticas independentes.
Mogelijke analyses zijn:
- HPLC;
- LC-MS;
- análise de aminoácidos;
- determinação da água;
- análise de contraíons;
- RMN;
- análise elementar;
- balanço de massas.
O objetivo é determinar com elevada fiabilidade:
- qual o material presente;
- qual é o seu grau de pureza;
- quanto do componente pretendido está presente;
- quais os fatores de correção necessários.
Um padrão primário pode então ser utilizado para qualificar outros padrões.
O que é um padrão de referência secundário?
Um padrão de referência secundário também é designado por:
- padrão de trabalho;
- padrão de trabalho;
- padrão de referência interno.
Este padrão é qualificado por comparação com um padrão primário ou com um padrão de referência oficialmente reconhecido.
Um padrão secundário pode ser utilizado para análises laboratoriais de rotina.
As possíveis vantagens incluem:
- maior disponibilidade;
- custos mais baixos;
- preservação do padrão primário;
- utilização de rotina mais eficiente.
No entanto, o padrão secundário deve ser verificado periodicamente e armazenado corretamente.
Por que razão não se utiliza sempre o padrão primário?
Os padrões primários podem:
- estarem disponíveis em quantidade limitada;
- serem dispendiosos;
- serem fornecidos em pequenas quantidades;
- destinarem-se a métodos analíticos oficiais específicos.
Ao qualificar um padrão secundário em relação a um padrão primário, é possível realizar análises de rotina sem utilizar continuamente o padrão primário.
A fiabilidade depende da qualidade da qualificação.
O que significa a qualificação de um padrão de trabalho?
A qualificação significa que as propriedades do padrão de trabalho são sistematicamente investigadas e comparadas com uma referência adequada.
Um programa de qualificação pode incluir:
- controlo da identidade;
- pureza por HPLC;
- ensaio do peptídeo;
- teor de água;
- teor de contra-iões;
- comparação de cromatogramas;
- comparação de espectros de massa;
- avaliação da estabilidade.
Os testes necessários dependem da utilização pretendida.
Identidade versus quantificação
Um padrão de referência pode ter várias funções analíticas.
Padrão de identidade
Utiliza-se um padrão de identidade para investigar se uma amostra desconhecida corresponde ao péptido esperado.
As comparações possíveis incluem:
- tempo de retenção por HPLC;
- massa molecular;
- perfil espectrométrico de massa;
- propriedades espectroscópicas.
Padrão quantitativo
Um padrão quantitativo é utilizado para determinar a quantidade de péptido.
Para tal, é necessário conhecer com fiabilidade suficiente o teor efetivo de péptido.
Uma elevada pureza por HPLC, por si só, geralmente não é suficiente para esse efeito.
Porque não é suficiente a pureza por HPLC?
Por exemplo, um péptido pode ter uma pureza por HPLC de 99%.
Isto não significa automaticamente que 99% da massa total seja constituída pelo péptido.
O material pode também conter:
- água;
- acetato;
- cloreto;
- TFA;
- sais;
- outros componentes não medidos por cromatografia.
Por conseguinte, para um padrão quantitativo, é necessário distinguir entre:
- pureza cromatográfica;
- massa total do material;
- teor líquido de péptido.
O que é o valor atribuído?
Um padrão de referência pode ter um valor atribuído.
Este valor descreve, por exemplo:
- teor de peptídeo;
- pureza;
- concentração;
- potência;
- quantidade por embalagem.
O valor atribuído deve basear-se em dados analíticos adequados.
Também pode ser indicado um fator de correção.
O que é um fator de correção?
É utilizado um fator de correção para converter a quantidade de material pesada na quantidade efetiva de péptido.
Suponha-se:
- material pesado: 10,0 mg;
- teor de péptido atribuído: 85%;
- quantidade efetiva de péptido: 8,5 mg.
Quando esta correção não é aplicada, a concentração calculada pode ser sobrestimada.
Porque é importante o teor líquido de péptido?
O teor líquido de péptido descreve a proporção de péptido efetivo no material analisado.
No cálculo, podem ser tidos em conta fatores como:
- humidade residual;
- contra-iões;
- componentes orgânicos;
- componentes inorgânicos.
Para a análise quantitativa, isto é frequentemente mais relevante do que apenas a pureza por HPLC.
Que papel desempenha a análise de aminoácidos?
A análise de aminoácidos pode ser utilizada para determinar o teor de péptido.
A cadeia peptídica é hidrolisada até aos aminoácidos individuais.
Em seguida, os aminoácidos selecionados são quantificados.
Quando se sabe quantos destes aminoácidos estão presentes em cada cadeia peptídica, é possível calcular a quantidade de péptido.
A análise de aminoácidos pode, assim, contribuir para a atribuição do valor de um padrão de referência.
Que papel desempenha a espectrometria de massa?
A espectrometria de massa pode ajudar a confirmar:
- massa molecular;
- identidade;
- determinadas modificações;
- produtos de degradação.
A LC-MS pode combinar a separação cromatográfica com a deteção de massa.
Uma massa molecular correspondente apoia a identidade, mas não a comprova por si só:
- quantidade exata de peptídeo;
- sequência completa;
- ausência de todas as impurezas.
Por isso, são frequentemente combinadas várias técnicas.
Que papel desempenha a MS/MS?
Na espectrometria de massa tandem, um ião peptídico selecionado é fragmentado.
Os fragmentos podem fornecer informações sobre a sequência de aminoácidos.
Por conseguinte, a MS/MS pode fornecer suporte adicional para:
- confirmação da sequência;
- localização das modificações;
- identificação de produtos de degradação.
A capacidade analítica depende de:
- tamanho do péptido;
- fragmentação;
- resolução do instrumento;
- processamento de dados.
Que função desempenha a HPLC?
A HPLC pode ser utilizada para:
- comparação dos tempos de retenção;
- avaliação da pureza cromatográfica;
- investigação de picos secundários;
- ensaio quantitativo;
- estudo de estabilidade.
Na comparação, o padrão de referência e a amostra devem ser analisados segundo o mesmo método controlado.
Os parâmetros importantes incluem:
- tipo de coluna;
- fase móvel;
- temperatuur;
- caudal;
- comprimento de onda de deteção.
O que é uma curva de calibração?
Uma curva de calibração descreve a relação entre concentrações conhecidas e os sinais medidos pelo detetor.
Uma curva de calibração fiável deve ser avaliada quanto a:
- lineariteit;
- intervalo de medição;
- reprodutibilidade;
- desvios;
- adequação ao método analítico.
A concentração desconhecida é calculada dentro do intervalo de medição validado.
A extrapolação para além deste intervalo pode causar incerteza adicional.
O que é a linearidade?
A linearidade descreve em que medida o sinal medido varia proporcionalmente à concentração.
Quando a concentração duplica, espera-se uma alteração correspondente do sinal dentro de um intervalo linear.
A relação não tem de ser linear para todos os métodos e em todos os intervalos de concentração.
Por isso, o intervalo de medição relevante é investigado experimentalmente.
O que significa rastreabilidade analítica?
A rastreabilidade analítica ou metrológica descreve como um resultado de medição está ligado a uma referência reconhecida através de uma cadeia documentada de comparações.
Os componentes importantes incluem:
- padrão utilizado;
- certificado;
- toegewezen waarde;
- calibração;
- método analítico;
- incerteza de medição;
- documentação.
A rastreabilidade apoia a comparabilidade dos resultados entre:
- diferentes dias de medição;
- laboratórios;
- instrumentos;
- lotes.
O que é a rastreabilidade metrológica?
A metrologia é a ciência da medição.
A rastreabilidade metrológica requer uma cadeia de comparação documentada e ininterrupta com uma referência especificada. Cada etapa contribui para a incerteza total de medição.
Para a análise de péptidos, a rastreabilidade prática pode depender, entre outros fatores, de:
- padrão de referência;
- teor de péptido atribuído;
- balança calibrada;
- equipamento volumétrico;
- método analítico.
O que é a incerteza de medição?
Todas as medições analíticas contêm incerteza.
As possíveis fontes incluem:
- incerteza do padrão de referência;
- pesagem;
- pipetagem;
- diluição;
- variação do instrumento;
- calibração;
- integração dos picos;
- preparação da amostra.
A incerteza de medição não significa que um resultado não seja fiável.
Descreve a dispersão estimada dentro da qual o valor verdadeiro pode razoavelmente situar-se.
Por que razão os padrões devem ser específicos de cada lote?
Os padrões de referência também são produzidos em lotes.
Os diferentes lotes podem diferir em:
- teor de peptídeo;
- teor de água;
- teor de contra-iões;
- perfil de pureza;
- estabilidade.
Por isso, deve ficar claro qual o número de lote do padrão de referência foi utilizado.
Wat staat er op een certificaat van een referentiestandaard?
Een certificaat kan informatie bevatten over:
- naam;
- catalogusnummer;
- lotnummer;
- toegewezen waarde;
- beoogd gebruik;
- opslagcondities;
- geldigheidsinformatie;
- analysemethoden;
- correctiefactor.
Niet elk certificaat bevat dezelfde gegevens.
De standaard moet worden gebruikt volgens de bijbehorende instructies.
Waarom zijn opslagcondities belangrijk?
Een referentiestandaard kan tijdens de opslag veranderen.
Mogelijke processen zijn:
- oxidatie;
- deamidatie;
- vochtopname;
- aggregatie;
- afbraak.
Daarom kunnen voorwaarden worden vastgesteld voor:
- temperatuur;
- bescherming tegen licht;
- bescherming tegen vocht;
- gebruik na opening;
- opslagduur.
Een standaard die verkeerd is opgeslagen, kan onjuiste vergelijkingen veroorzaken.
Wat is een vervaldatum?
Sommige referentiestandaarden hebben een vastgestelde vervaldatum.
Andere standaarden werken met:
- geldigheidscontrole;
- herkwalificatiedatum;
- actuele lotstatus.
Het laboratorium moet controleren of de standaard op het moment van gebruik geschikt en geldig is.
Wat is herkwalificatie?
Herkwalificatie is het opnieuw beoordelen van een referentiestandaard.
Mogelijke analyses zijn:
- HPLC;
- LC-MS;
- ensaio do peptídeo;
- teor de água;
- vergelijking met een primaire standaard.
Herkwalificatie kan nodig zijn na:
- vooraf bepaalde gebruiksduur;
- langdurige opslag;
- verandering in uiterlijk;
- afwijkend analyseresultaat.
Waarom zijn onzuiverheidsstandaarden belangrijk?
Niet alleen het gewenste peptide kan als standaard worden gebruikt.
Ook bekende onzuiverheden of degradatieproducten kunnen als referentiemateriaal dienen.
São exemplos:
- oxidatieproducten;
- gedeamideerde varianten;
- fragmenten;
- deletiesequenties;
- aggregatiegerelateerde componenten.
Deze standaarden kunnen helpen om nevenpieken te identificeren en te kwantificeren.
Wat zijn degradatiestandaarden?
Een degradatiestandaard vertegenwoordigt een bekende afbraakvariant.
Deze kan worden gebruikt om te onderzoeken:
- waar een degradatieproduct elueert;
- welke moleculaire massa aanwezig is;
- hoe gevoelig de analysemethode is;
- hoeveel degradatieproduct aanwezig is.
Niet elk degradatieproduct is als zuivere standaard beschikbaar.
Referentiestandaarden en methodevalidatie
Een analysemethode moet aantoonbaar geschikt zijn voor het beoogde doel.
ICH Q2(R2) beschrijft principes voor de validatie van analytische procedures. Relevante kenmerken kunnen onder andere specificiteit, nauwkeurigheid, precisie, lineariteit en meetbereik omvatten.
Referentiestandaarden kunnen worden gebruikt bij het onderzoeken van:
- nauwkeurigheid;
- specificiteit;
- lineariteit;
- kwantitatief bereik;
- methodeprestaties.
Wat is nauwkeurigheid?
De nauwkeurigheid beschrijft hoe dicht een gemeten resultaat bij een aanvaarde referentiewaarde ligt.
Een goed gekarakteriseerde standaard kan worden gebruikt om de nauwkeurigheid van een analysemethode te onderzoeken.
Wat is precisie?
De precisie beschrijft hoe dicht herhaalde meetresultaten bij elkaar liggen.
Um método pode produzir resultados muito precisos que, ainda assim, apresentam um desvio sistemático.
Por isso, tanto a precisão como a exatidão são importantes.
O que é a especificidade?
A especificidade descreve se o método analítico consegue distinguir suficientemente o componente pretendido dos outros componentes.
São exemplos:
- impurezas;
- produtos de degradação;
- componentes da formulação;
- contra-iões.
Um padrão de referência adequado pode ajudar na identificação do pico principal.
Dois laboratórios podem obter resultados diferentes?
Sim.
As diferenças podem surgir devido a:
- padrão de referência;
- método analítico;
- preparação da amostra;
- equipamento;
- calibração;
- processamento de dados;
- incerteza de medição.
A utilização de padrões bem caracterizados e de métodos validados pode melhorar a comparabilidade.
Um peptídeo comercial é automaticamente um padrão de referência?
Não.
Um peptídeo comercial pode ser adequado como material de investigação, mas não é automaticamente um padrão de referência qualificado.
Para ser utilizado como padrão, deve estar claramente definido:
- identidade;
- teor de peptídeo;
- pureza;
- teor de água;
- teor de contra-iões;
- estabilidade durante o armazenamento;
- documentação.
Os requisitos dependem do objetivo analítico.
Padrões de referência farmacopêicos oficiais
As organizações oficiais disponibilizam padrões de referência para aplicações compendiais específicas.
São exemplos:
- Padrões de Referência da USP;
- Padrões de Referência da Farmacopeia Europeia;
- Substâncias Químicas de Referência Internacionais da OMS.
Estes padrões destinam-se às aplicações descritas nos métodos oficiais ou na documentação correspondente.
Não existe um padrão farmacopêico oficial para todos os peptídeos de investigação.
Limitações científicas
Um padrão de referência melhora a comparabilidade analítica, mas não resolve todos os desafios de medição.
A fiabilidade continua dependente de:
- método analítico;
- preparação da amostra;
- instrumento;
- calibração;
- armazenamento;
- processamento de dados;
- incerteza de medição.
Um tempo de retenção correspondente por HPLC não comprova, por si só, a identidade molecular completa.
Uma massa molecular correspondente não comprova automaticamente:
- sequência completa correta;
- quantidade exata de peptídeo;
- ausência de todas as impurezas.
Por isso, são utilizadas várias técnicas analíticas complementares.
Resumo
Um padrão de referência de peptídeos é um material bem caracterizado utilizado como base de comparação analítica.
Os padrões de referência podem ser utilizados para:
- identificação;
- comparação por HPLC;
- calibração;
- ensaio do peptídeo;
- quantificação;
- validação do método;
- análise de impurezas.
Um padrão primário é extensivamente caracterizado.
Um padrão secundário ou de trabalho é qualificado em relação a uma referência primária adequada e pode ser utilizado para análises de rotina.
Para aplicações quantitativas, a pureza por HPLC, por si só, é geralmente insuficiente. Também devem ser avaliados o teor de peptídeo, a água, os contra-iões e outros componentes relevantes.
Uma comparação analítica fiável exige:
- padrão de referência adequado;
- atribuição correta de valores;
- rastreabilidade do lote;
- armazenamento controlado;
- método analítico validado;
- avaliação da incerteza de medição.
Fontes oficiais e referências científicas
-
ICH Q2(R2) — Validação de Procedimentos Analíticos
Orientação internacional para a validação de procedimentos analíticos, incluindo especificidade, exatidão, precisão, linearidade e intervalo de medição. -
USP — Padrões de Referência Oficiais
A USP descreve os padrões de referência como materiais amplamente caracterizados, destinados, entre outros fins, à investigação da identidade, potência, pureza e qualidade. -
Padrões de Referência da Farmacopeia Europeia — EDQM
O catálogo da EDQM contém padrões de referência oficialmente válidos para as utilizações descritas na Farmacopeia Europeia. -
OMS — Substâncias Químicas Internacionais de Referência
Os WHO-ICRS são estabelecidos através de procedimentos alinhados com as orientações da OMS para substâncias químicas de referência. -
NIST — Rastreabilidade Metrológica
O NIST descreve a rastreabilidade metrológica como uma cadeia documentada e ininterrupta de calibrações até referências especificadas. -
NIST — Materiais de Referência Padrão
O NIST desenvolve e certifica materiais de referência com composição ou propriedades bem caracterizadas, de modo a apoiar medições fiáveis e comparáveis. -
FDA — Procedimentos Analíticos e Validação de Métodos para Medicamentos e Produtos Biológicos
As orientações da FDA abordam a utilização e a qualificação de padrões de referência no âmbito da validação de métodos analíticos.
Aviso de investigação
Os péptidos de investigação da Peptidera são disponibilizados exclusivamente para Research Use Only (RUO) e destinam-se à investigação laboratorial e a aplicações analíticas.
Não se destina ao consumo humano ou animal, a utilização diagnóstica, a aplicação terapêutica ou a autoadministração.
Categoria:
Conhecimentos sobre péptidos & controlo de qualidade
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Sugestões de ligações internas:
- Ligação para PB-0230 sobre o tempo de retenção em HPLC e a comparação cromatográfica
- Ligação para PB-0231 sobre LC-MS, massa molecular e MS/MS
- Ligação para PB-0233 sobre ensaios quantitativos de péptidos
- Ligação para PB-0238 sobre contraíons e teor líquido de péptido
- Ligação para PB-0239 sobre a análise de aminoácidos e a atribuição de valores
- Ligação para PB-0241 sobre a rastreabilidade de padrões e amostras
- Ligação para a página da Peptidera com certificados de análise independentes
- Ligação para a coleção de péptidos de investigação