Pureza do peptídeo: o que significa 99% HPLC?
Pureza do péptido explicada: o que significa realmente uma percentagem de HPLC?
No caso de péptidos para investigação, é frequentemente indicada uma percentagem de pureza. Valores como 98%, 99% ou 99,5% de pureza são utilizados regularmente para descrever a qualidade de um péptido.
Uma percentagem elevada parece simples de interpretar: quanto maior o número, melhor o produto. Na prática, a pureza do péptido é mais complexa.
Um resultado de HPLC fornece informações sobre a composição relativa de uma amostra analisada. No entanto, a percentagem não comprova automaticamente:
- que está presente o péptido correto;
- que a sequência de aminoácidos está totalmente correta;
- que a quantidade de péptido indicada no vial está correta;
- que o material é estéril;
- que está isento de endotoxinas;
- que todas as possíveis impurezas foram medidas.
Para avaliar cuidadosamente a qualidade de um péptido, é necessário analisar conjuntamente vários dados analíticos.
Neste artigo, explicamos como é medida a pureza do péptido, o que significa uma percentagem de HPLC e por que razão a pureza constitui apenas um elemento do controlo de qualidade completo.
O que significa pureza do péptido?
A pureza do péptido descreve a proporção dos componentes relacionados com o péptido detetados que corresponde ao componente principal da amostra analisada.
Por exemplo, quando um certificado de análise indica uma pureza por HPLC de 99% quando indica, isso significa geralmente que aproximadamente 99% do sinal cromatográfico integrado foi atribuído ao pico principal.
Isto não significa automaticamente que 99% do peso total do vial seja constituído pelo péptido pretendido.
Um vial pode conter, além do péptido, outros componentes, tais como:
- água;
- contraíões;
- sais;
- excipientes;
- resíduos do processo de produção;
- componentes não detetáveis.
A percentagem de HPLC e a quantidade real de péptido são, por isso, diferentes parâmetros de qualidade.
O que é HPLC?
HPLC significa High-Performance Liquid Chromatography.
É uma técnica analítica que permite separar entre si diferentes componentes químicos presentes numa amostra.
Durante uma análise por HPLC, uma amostra dissolvida é conduzida através de uma coluna. Esta coluna contém uma fase estacionária.
O líquido que flui através da coluna é designado por fase móvel.
As diferentes moléculas não interagem todas da mesma forma com estas fases. Por isso, alguns componentes deslocam-se mais rapidamente pela coluna do que outros.
O resultado é apresentado num cromatograma.
Um cromatograma é geralmente constituído por:
- um eixo horizontal do tempo;
- um eixo vertical do sinal;
- um ou vários picos.
Cada pico representa um componente detetado ou um grupo de componentes.
O que é um tempo de retenção?
O tempo necessário para que um componente percorra a coluna de HPLC e alcance o detetor é designado por tempo de retenção.
O tempo de retenção pode ser influenciado por:
- tipo de coluna de HPLC;
- composição da fase móvel;
- temperatura;
- caudal;
- propriedades do péptido;
- método analítico utilizado.
Um tempo de retenção correspondente pode ajudar na comparação com um padrão de referência.
No entanto, um tempo de retenção, por si só, é geralmente insuficiente para confirmar definitivamente a identidade de um péptido.
Diferentes moléculas podem apresentar tempos de retenção semelhantes em determinadas condições.
Por isso, a HPLC é frequentemente combinada com a espectrometria de massas.
Como é calculada a percentagem de pureza?
Em muitas análises por HPLC, calcula-se a área sob cada pico cromatográfico.
Isto é designado por integração da área dos picos.
Um exemplo simplificado:
- pico principal: 99%;
- pico secundário A: 0,5%;
- pico secundário B: 0,3%;
- restantes picos detetados: 0,2%.
A pureza cromatográfica comunicada é então de aproximadamente 99%.
Este cálculo depende de:
- método de deteção;
- parâmetros de integração;
- comprimento de onda selecionado;
- método analítico;
- limite de deteção;
- concentração da amostra.
Por isso, uma percentagem de pureza deve ser sempre interpretada no contexto do método utilizado.
O que significa um pico principal?
O maior pico de um cromatograma é frequentemente designado por pico principal.
Num péptido bem caracterizado, espera-se que este pico corresponda ao péptido pretendido.
No entanto, isso deve ser confirmado analiticamente.
Um pico elevado, por si só, não comprova a presença da estrutura molecular correta.
Para apoiar a identificação, podem ser utilizadas técnicas adicionais, tais como:
- espectrometria de massa;
- análise de aminoácidos;
- análise de sequência;
- ressonância magnética nuclear;
- comparação com um padrão de referência.
A HPLC descreve principalmente a composição cromatográfica da amostra.
Que impurezas podem surgir durante a síntese de péptidos?
Muitos péptidos sintéticos são produzidos através da síntese de péptidos em fase sólida, geralmente abreviada como SPPS.
Durante este processo, os aminoácidos são acoplados progressivamente a uma cadeia peptídica em crescimento.
Podem ocorrer pequenas variações do processo em cada etapa.
As possíveis impurezas relacionadas com o péptido incluem:
Cadeias peptídicas truncadas
Quando um aminoácido não é acoplado corretamente, pode formar-se uma cadeia peptídica incompleta.
Também é designado por produto de truncagem.
Sequências de deleção
Numa sequência com deleção, falta um ou mais aminoácidos na cadeia pretendida.
Por conseguinte, a massa molecular difere da do péptido pretendido.
Variantes quimicamente modificadas
Durante a produção, purificação ou armazenamento, podem ocorrer alterações químicas.
Exemplos:
- oxidação;
- desamidação;
- hidrólise;
- isomerização.
Resíduos de grupos protetores
Durante a síntese de péptidos, são utilizados grupos protetores temporários para evitar reações indesejadas.
Estes têm de ser removidos posteriormente.
A remoção incompleta pode contribuir para a formação de componentes secundários.
Agregados
As moléculas de péptido podem formar estruturas maiores em determinadas condições.
Nem todos os métodos de HPLC detetam ou caracterizam a agregação da mesma forma.
Uma pureza de 99% por HPLC é o mesmo que um teor de péptido de 99%?
Não.
Esta é uma distinção importante.
Pureza por HPLC descreve geralmente a proporção relativa dos componentes cromatográficos detetados.
Teor de péptido descreve a quantidade de péptido efetivamente presente em relação ao material total.
Por exemplo, um frasco de produto liofilizado pode conter:
- o péptido pretendido;
- água;
- contraíões;
- sais;
- excipientes.
Estes componentes não são necessariamente todos medidos da mesma forma durante uma análise HPLC padrão.
Por isso, uma amostra pode apresentar uma elevada pureza cromatográfica, embora o teor total de péptido seja inferior à percentagem de HPLC.
Para a determinação quantitativa, são necessários métodos analíticos adicionais.
O que é um ensaio de péptidos?
Um ensaio é utilizado para determinar a quantidade ou concentração de um componente específico.
Dependendo do objetivo da investigação, podem ser utilizados diferentes métodos.
Exemplos:
- HPLC quantitativa com padrão de referência;
- análise de aminoácidos;
- análise de azoto;
- técnicas espectroscópicas;
- cálculos de balanço de massa.
Um ensaio responde a uma pergunta diferente da de uma análise de pureza padrão.
A análise da pureza requer:
Que parte dos componentes peptídicos detetados pertence ao pico principal?
Um ensaio quantitativo requer:
Que quantidade do péptido pretendido está efetivamente presente?
Ambos os dados podem ser relevantes para uma caracterização completa da qualidade.
Porque é importante a espectrometria de massa?
A espectrometria de massa, frequentemente abreviada como MS, mede a razão massa/carga de moléculas ionizadas.
Na análise de péptidos, pode verificar-se se a massa molecular medida corresponde à massa teoricamente esperada.
A espectrometria de massa pode contribuir para:
- confirmação da identidade;
- deteção de determinadas modificações;
- análise de produtos de degradação;
- comparação de variantes de péptidos.
Quando a massa medida corresponde à massa esperada, isso apoia a identificação.
Ainda assim, a espectrometria de massa não fornece automaticamente informações completas sobre:
- percentagem de pureza;
- quantidade exata;
- esterilidade;
- endotoxinas;
- atividade biológica.
Por isso, a HPLC e a espectrometria de massa complementam-se.
O que é a LC-MS?
A LC-MS combina cromatografia líquida com espectrometria de massa.
Primeiro, os componentes são separados por cromatografia. Depois, os sinais individuais são analisados mais detalhadamente por espectrometria de massa.
Esta combinação pode fornecer informações sobre:
- tempo de retenção;
- massa molecular;
- possíveis impurezas;
- produtos de degradação;
- modificações químicas.
Deste modo, a LC-MS pode fornecer mais informação analítica do que uma única técnica isolada.
A qualidade dos resultados continua a depender de:
- preparação da amostra;
- definições do instrumento;
- validação do método;
- materiais de referência;
- interpretação especializada.
Porque é que diferentes laboratórios podem medir resultados diferentes?
O mesmo péptido pode produzir resultados ligeiramente diferentes em diferentes laboratórios.
As possíveis causas são:
- diferentes colunas de HPLC;
- outras fases móveis;
- gradientes diferentes;
- outros comprimentos de onda de deteção;
- diferenças na preparação da amostra;
- outras definições de integração;
- variação do instrumento.
Uma diferença não significa automaticamente que uma das análises esteja incorreta.
Para comparar corretamente os resultados, também é necessário analisar o método analítico.
Uma percentagem sem informação sobre o método fornece apenas um contexto limitado.
O que é a validação do método?
Um método analítico deve demonstrar ser adequado à finalidade pretendida.
A isto chama-se validação do método.
As possíveis características de validação incluem:
- especificidade;
- exatidão;
- precisão;
- linearidade;
- intervalo de medição;
- limite de deteção;
- limite de quantificação;
- robustez.
Um método de identificação não é automaticamente adequado para uma quantificação exata.
Por isso, deve ser previamente claro qual a questão analítica que está a ser investigada.
O que é o limite de deteção?
Cada método analítico tem um limite abaixo do qual um componente não pode ser detetado de forma fiável.
A isto chama-se limite de deteção.
Por isso, um componente que não é visível num cromatograma não está automaticamente totalmente ausente.
A concentração pode ser inferior ao limite de deteção.
Além disso, determinadas substâncias podem:
- não reagirem ao detetor utilizado;
- ficarem fora do intervalo de medição;
- perderem-se durante a preparação da amostra;
- não serem separados de forma suficiente.
A expressão «não detetado» não é, por isso, sempre o mesmo que «não presente».
Um cromatograma pode ser manipulado?
Um cromatograma deve conter informação suficiente para poder ser avaliado profissionalmente.
Os dados importantes são:
- nome do produto;
- número do lote;
- data da análise;
- método utilizado;
- definições do detetor;
- tempos de retenção;
- integração dos picos;
- dados laboratoriais.
Apenas uma imagem com um pico grande e uma percentagem proporciona uma verificabilidade limitada.
Além disso, as definições de integração podem influenciar os sinais incluídos no cálculo.
Por isso, uma comunicação transparente é importante.
Que informação deve constar de um COA fiável?
Um Certificado de Análise pode incluir, entre outros:
- nome do péptido;
- sequência de aminoácidos;
- número do lote;
- data de produção;
- data do teste;
- resultado de HPLC;
- cromatograma;
- resultado da espectrometria de massa;
- massa molecular teórica;
- massa molecular medida;
- métodos analíticos utilizados;
- nome do laboratório.
Nem todos os COA incluem todos os elementos.
A informação necessária depende do produto e do objetivo da investigação.
Um COA abrangente pode proporcionar maior transparência, mas a fiabilidade também depende da qualidade da análise.
É sempre necessária uma pureza elevada?
A pureza pretendida depende do objetivo da investigação.
Em algumas aplicações analíticas, quantidades muito pequenas de componentes secundários podem influenciar:
- resultados de medição;
- investigação de recetores;
- investigação celular;
- reprodutibilidade.
Nesse caso, poderá ser desejável um nível de pureza mais elevado.
No entanto, uma percentagem mais elevada não significa automaticamente que todas as outras características de qualidade sejam melhores.
Por exemplo, um péptido com 99,5% de pureza por HPLC pode ainda:
- conter uma quantidade diferente da indicada;
- ter sido armazenados incorretamente;
- não estar adequadamente identificados;
- conter um teor elevado de humidade residual;
- ter uma embalagem danificada.
Por isso, a qualidade deve ser avaliada de forma multidimensional.
Pureza e diferenças entre lotes
Cada lote de produção tem o seu próprio processo de produção e análise.
Por isso, os resultados de pureza podem variar entre lotes.
Uma análise de um único lote não deve ser automaticamente utilizada como prova para todos os lotes futuros.
A análise específica do lote apoia:
- rastreabilidade;
- comparação;
- controlo de qualidade;
- investigação de desvios.
Por isso, o número do lote no frasco deve corresponder ao número indicado no certificado de análise.
Pureza e estabilidade
Uma pureza inicial elevada não garante que esta se mantenha durante um armazenamento prolongado.
Os possíveis processos de degradação são:
- oxidação;
- hidrólise;
- desamidação;
- agregação.
A velocidade é influenciada por:
- temperatura;
- humidade;
- luz;
- oxigénio;
- sequência de aminoácidos;
- embalagem.
Os estudos de estabilidade podem ser utilizados para acompanhar alterações no perfil cromatográfico ao longo do tempo.
Limitações científicas
Nenhum método analítico fornece, por si só, uma imagem completa da qualidade dos péptidos.
A HPLC pode fornecer informações importantes sobre a pureza cromatográfica, mas tem limitações.
Uma percentagem de HPLC não prova automaticamente:
- identidade;
- quantidade exata de péptido;
- sequência de aminoácidos;
- esterilidade;
- teor de endotoxinas;
- atividade biológica;
- estabilidade a longo prazo.
Por isso, combinam-se vários métodos analíticos.
Uma avaliação completa da qualidade pode incluir:
- HPLC;
- espectrometria de massa;
- ensaio quantitativo;
- análise de humidade;
- estudos de estabilidade;
- testes adicionais específicos do produto.
Resumo
A pureza do péptido é um parâmetro de qualidade importante, mas uma percentagem de HPLC deve ser interpretada corretamente.
Um valor de 99% significa normalmente que cerca de 99% do sinal cromatográfico integrado foi atribuído ao pico principal.
Não significa automaticamente que:
- 99% do peso do frasco é constituído por péptido;
- a identidade foi totalmente confirmada;
- a quantidade indicada está correta;
- o material é estéril;
- todas as possíveis impurezas foram excluídas.
Para uma avaliação mais abrangente da qualidade, os resultados de HPLC devem ser combinados com outros dados, tais como:
- espectrometria de massa;
- informação sobre o lote;
- análise quantitativa;
- dados de armazenamento;
- estudos de estabilidade.
A qualidade dos péptidos consiste, por isso, em mais do que uma percentagem.
Aviso de investigação
Os péptidos de investigação da Peptidera são disponibilizados exclusivamente para Research Use Only (RUO) e destinam-se à investigação laboratorial e a aplicações analíticas.
Não se destina ao consumo humano ou animal, a utilização diagnóstica, a aplicações terapêuticas ou à autoadministração.
Categoria:
Conhecimentos sobre péptidos e controlo de qualidade
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