Humidade residual em peptídeos liofilizados explicada
Humidade residual em peptídeos liofilizados: impacto na estabilidade e na qualidade
Os peptídeos de investigação liofilizados são frequentemente fornecidos sob a forma de uma estrutura seca e porosa, num frasco de vidro fechado. Ao remover grande parte da água durante o processo de liofilização, é possível limitar o movimento molecular e determinados processos de degradação química.
Ainda assim, liofilizado não significa automaticamente totalmente isento de água.
Após a liofilização, pode permanecer uma pequena quantidade de água no produto. Esta é designada por humidade residual, humidade remanescente ou residual moisture.
A quantidade de humidade residual pode influenciar:
- estabilidade química;
- estabilidade física;
- mobilidade molecular;
- agregação;
- oxidação;
- a estrutura da matriz liofilizada;
- estabilidade durante o armazenamento.
Um teor de humidade muito elevado pode acelerar determinados processos de degradação. No entanto, um teor de humidade extremamente baixo não é automaticamente ideal para todas as formulações de peptídeos. Algumas estruturas moleculares podem, pelo contrário, beneficiar de uma quantidade limitada de água ligada.
O valor desejado de humidade residual depende, por isso, do peptídeo específico, da formulação, da embalagem e das condições de armazenamento.
Neste artigo, abordamos como se forma a humidade residual, como é medida e por que razão a análise da humidade pode ser uma parte importante dos estudos de estabilidade de peptídeos de investigação liofilizados.
O que é a humidade residual?
A humidade residual é a quantidade de água que permanece num produto liofilizado após o processo de secagem.
Esta água pode encontrar-se:
- entre moléculas;
- à superfície da estrutura liofilizada;
- em poros microscópicos;
- ligada a grupos peptídicos;
- ligada a excipientes;
- em equilíbrio com a fase gasosa no frasco.
A humidade residual é geralmente expressa como uma percentagem da massa total.
Um resultado hipotético poderia ser, por exemplo:
Humidade residual: 1,8%
Isto significa que, segundo o método de medição utilizado, aproximadamente 1,8% da massa analisada é atribuída à água.
O significado deste valor depende de:
- especificação do produto;
- método analítico utilizado;
- propriedades do peptídeo;
- formulação;
- objetivo de armazenamento.
Por que razão são liofilizados os peptídeos?
Os peptídeos podem ser suscetíveis a várias alterações químicas e físicas quando se encontram numa solução aquosa.
Os processos possíveis incluem:
- hidrólise;
- oxidação;
- desamidação;
- agregação;
- alterações estruturais.
Ao congelar uma solução e, em seguida, remover grande parte da água sob pressão reduzida, forma-se uma matriz seca.
Este processo é denominado:
- liofilização;
- liofilização;
- liofilização.
O objetivo não é apenas remover água.
Um processo de liofilização bem desenvolvido também deve contribuir para:
- preservação da integridade molecular;
- formação de um bolo estável;
- qualidade do produto reprodutível;
- solubilidade adequada para investigação analítica.
Como se forma a humidade residual?
Durante a liofilização, a água é removida em várias fases.
As principais fases do processo são:
- congelação;
- secagem primária;
- secagem secundária.
Cada fase influencia a quantidade final de humidade residual.
Fase 1: congelação
Durante a fase de congelação, a solução de péptidos é arrefecida.
Grande parte da água forma cristais de gelo.
Outros componentes ficam concentrados nas partes não congeladas da solução.
A forma como o produto congela pode influenciar:
- tamanho dos cristais de gelo;
- estrutura dos poros;
- tempo de secagem;
- distribuição dos componentes;
- estrutura final do produto.
Cristais de gelo maiores podem deixar poros maiores após a sublimação.
Isto pode influenciar o transporte de vapor de água durante a secagem primária.
Fase 2: secagem primária
Durante a fase de secagem primária, a pressão é reduzida.
A água congelada é então removida por sublimação.
Sublimação significa que o gelo passa diretamente do estado sólido para vapor de água.
A temperatura do produto deve ser cuidadosamente controlada durante esta fase.
Quando a temperatura fica demasiado elevada, a estrutura pode colapsar.
Isto é por vezes designado por:
colapso do bolo
Uma estrutura colapsada pode influenciar:
- aspeto;
- porosidade;
- comportamento de secagem;
- solubilidade;
- estabilidade.
Após a fase de secagem primária, grande parte do gelo livre foi removida.
Ainda assim, pode permanecer alguma água ligada.
Fase 3: secagem secundária
Durante a fase de secagem secundária, a água mais fortemente ligada é removida adicionalmente.
Isto é geralmente conseguido aumentando de forma controlada a temperatura do produto, mantendo a baixa pressão.
O objetivo é reduzir a humidade residual para um valor previamente definido.
O valor final ideal varia consoante o produto.
Uma secagem secundária demasiado curta pode conduzir a:
- maior humidade residual;
- maior mobilidade molecular;
- estabilidade reduzida.
Uma fase de secagem demasiado intensa também pode ter efeitos adversos em algumas formulações.
Por isso, o processo é desenvolvido especificamente para cada produto.
Um péptido liofilizado está completamente seco?
Normalmente, não.
O termo liofilizado significa que uma grande parte da água foi removida.
Isto não significa automaticamente que o produto contenha 0% de água.
As moléculas de água podem permanecer fortemente ligadas a:
- grupos de aminoácidos polares;
- ligações peptídicas;
- sais;
- componentes da formulação.
A remoção completa pode ser tecnicamente difícil e nem sempre é desejável.
Por isso, geralmente trabalha-se com um intervalo aceitável de humidade residual.
Porque pode o excesso de humidade residual ser um problema?
A água pode aumentar a mobilidade molecular.
Quando as moléculas se movem mais facilmente, determinadas reações químicas podem ocorrer mais rapidamente.
Um teor elevado de humidade residual pode, em determinadas condições, contribuir para:
- hidrólise;
- desamidação;
- alterações oxidativas;
- agregação;
- instabilidade estrutural.
A influência depende da:
- sequência peptídica;
- temperatura;
- oxigénio;
- luz;
- microambiente de pH;
- tempo de armazenamento.
Assim, a humidade residual é um fator de estabilidade e deve ser avaliada em conjunto com outras condições.
O que é a mobilidade molecular?
Numa matriz liofilizada seca, as moléculas têm os seus movimentos relativamente limitados.
A água pode funcionar como um plastificante molecular.
Consequentemente, os movimentos moleculares podem aumentar.
Uma mobilidade mais elevada pode aumentar a probabilidade de os grupos reativos entrarem em contacto.
Isto pode influenciar determinadas reações de degradação.
No entanto, a relação entre o teor de água e a estabilidade nem sempre é linear.
Mais água não significa, em todas as circunstâncias, uma degradação exatamente proporcionalmente maior.
Um teor de humidade extremamente baixo também pode ser prejudicial?
Sim, é possível.
Um teor de humidade muito baixo não é automaticamente ideal para todos os péptidos.
Uma quantidade limitada de água ligada pode contribuir para:
- manutenção de determinadas interações moleculares;
- estabilização da estrutura;
- redução da tensão mecânica.
Uma secagem excessiva pode causar alterações em algumas formulações ao nível da:
- estrutura molecular;
- matriz do produto;
- solubilidade.
Por conseguinte, o teor de humidade residual pretendido deve ser determinado experimentalmente.
O que é um cake liofilizado?
Após a liofilização, permanece geralmente uma estrutura sólida porosa.
É frequentemente designado por lyophilized cake.
Um cake bem formado pode apresentar características como:
- estrutura uniforme;
- porosidade adequada;
- contração limitada;
- sem colapso visível.
No entanto, o aspeto não fornece informações completas sobre a qualidade.
Um cake visualmente uniforme pode ainda apresentar um teor de humidade anómalo.
Inversamente, uma forma anómala não significa automaticamente que a qualidade molecular seja insuficiente.
A avaliação analítica continua a ser necessária.
O aspeto pode indicar a presença de humidade residual?
Não.
O teor de humidade residual não pode ser determinado de forma fiável apenas observando o frasco.
As possíveis alterações visuais incluem:
- contração;
- colapso;
- aderência;
- descoloração;
- alteração da estrutura.
Estes fenómenos podem ter várias causas.
Para uma determinação quantitativa, é necessário um método analítico adequado.
Como é medido o teor de humidade residual?
Podem ser utilizadas várias técnicas.
Veelgebruikte methoden zijn:
- titulação de Karl Fischer;
- thermogravimetrische analyse;
- perda por secagem;
- spectroscopische methoden.
Iedere methode meet vocht op een andere manier.
De resultaten zijn daarom niet altijd rechtstreeks uitwisselbaar.
Wat is Karl Fischer-titratie?
Karl Fischer-titratie is een veelgebruikte methode voor waterbepaling.
De methode maakt gebruik van een chemische reactie die specifiek gevoelig is voor water.
De hoeveelheid verbruikt reagens wordt gebruikt om het watergehalte te berekenen.
Karl Fischer-analyse kan geschikt zijn voor lage vochtconcentraties.
Er bestaan verschillende uitvoeringen:
- volumetrische Karl Fischer-titratie;
- coulometrische Karl Fischer-titratie.
De geschikte methode hangt af van de hoeveelheid water en het type monster.
Coulometrische Karl Fischer-analyse
Coulometrische Karl Fischer-titratie wordt vaak gebruikt bij kleine hoeveelheden water.
Tijdens de analyse wordt het benodigde reagens elektrochemisch gevormd.
De hoeveelheid elektrische lading wordt gebruikt om het watergehalte te berekenen.
Mogelijke voordelen zijn:
- gevoeligheid;
- geschiktheid voor lage vochtwaarden;
- kleine monsterhoeveelheden.
De betrouwbaarheid hangt af van:
- monstervoorbereiding;
- volledige waterextractie;
- apparatuur;
- kalibratie;
- achtergrondcorrectie.
Wat is loss on drying?
Bij loss on drying, afgekort LOD, wordt een monster gewogen vóór en na gecontroleerde droging.
Het massaverlies wordt berekend.
Deze methode meet niet altijd uitsluitend water.
Ook andere vluchtige componenten kunnen tijdens het droogproces verdwijnen.
Daarom is loss on drying niet automatisch gelijk aan een specifieke waterbepaling.
Wat is thermogravimetrische analyse?
Thermogravimetrische analyse wordt afgekort tot TGA.
Tijdens TGA wordt de massa van een monster gemeten terwijl de temperatuur gecontroleerd verandert.
Massaverlies kan informatie geven over:
- vocht;
- vluchtige componenten;
- thermische veranderingen.
De interpretatie vereist kennis van:
- temperatuurprofiel;
- productsamenstelling;
- mogelijke ontledingsprocessen.
Waarom kan de meetmethode verschil maken?
Niet iedere methode detecteert water op dezelfde manier.
Sommige technieken meten:
- specifiek water;
- totaal massaverlies;
- vrij water;
- gebonden water.
Daardoor kunnen verschillende methoden verschillende waarden opleveren.
Een restvochtresultaat moet daarom altijd worden beoordeeld samen met:
- methode;
- meetcondities;
- productspecificatie.
Welke rol speelt de rubberen stop?
Na lyofilisatie moet de vial goed worden afgesloten.
De rubberen stop vormt een belangrijke barrière tegen vocht uit de omgeving.
A proteção depende de:
- material da rolha;
- selagem;
- posicionamento;
- compatibilidade;
- tempo de armazenamento.
Um vial insuficientemente fechado pode absorver humidade.
Por isso, a integridade da embalagem é importante para a estabilidade.
Que função desempenha a cápsula de alumínio?
A cápsula de alumínio mantém mecanicamente a rolha de borracha no lugar.
Uma cravação correta contribui para:
- integridade do fecho;
- proteção contra o movimento da rolha;
- selagem consistente.
Uma cápsula de alumínio danificada ou solta pode justificar uma inspeção adicional.
No entanto, só o aspeto não prova que o fecho seja completamente estanque.
A humidade pode penetrar nos materiais de embalagem?
Os materiais de embalagem formam barreiras, mas nenhum sistema é absolutamente impermeável em todas as condições.
Os possíveis fatores incluem:
- tipo de material;
- duração do armazenamento;
- temperatura;
- humidade do ar;
- qualidade do fecho.
A exposição prolongada a humidade elevada pode aumentar a probabilidade de absorção de humidade quando a barreira da embalagem é insuficiente.
O que é a integridade do sistema de fecho do recipiente?
A integridade do sistema de fecho do recipiente descreve o grau em que o vial, a rolha e a cápsula de alumínio formam conjuntamente um fecho protetor.
Isto é frequentemente abreviado como:
CCI
A investigação da integridade da embalagem pode incidir sobre:
- fugas;
- troca de gases;
- entrada de humidade;
- danos mecânicos.
Um fecho adequado contribui para a manutenção do ambiente interno.
Que influência tem a temperatura de armazenamento?
A temperatura pode influenciar:
- movimento molecular;
- reações químicas;
- migração de humidade;
- estabilidade física.
Temperaturas mais elevadas podem acelerar determinados processos de degradação.
A humidade residual e a temperatura podem influenciar-se mutuamente.
Um produto com maior humidade residual pode eventualmente alterar-se mais rapidamente a temperaturas mais elevadas do que em condições controladas mais frescas.
A estabilidade real deve ser investigada experimentalmente.
Porque é importante a humidade do ar?
Quando um vial é aberto ou não é devidamente fechado, a humidade ambiente pode exercer influência.
O grau de absorção de humidade depende de:
- humidade relativa;
- duração da exposição;
- higroscopicidade;
- estrutura do produto.
Alguns materiais liofilizados atraem humidade mais facilmente do que outros.
A isto chama-se higroscopicidade.
O que significa higroscópico?
Um material higroscópico tende a atrair água do ambiente.
As possíveis consequências incluem:
- maior teor de humidade;
- alteração da estrutura do bolo;
- aderência;
- maior mobilidade molecular.
O grau de higroscopicidade depende da composição do produto.
O transporte pode ter influência?
O transporte pode expor o produto a:
- variações de temperatura;
- vibrações;
- alterações de pressão;
- humidade do ar variável.
Quando o frasco está bem fechado, a absorção direta de humidade é limitada.
Ainda assim, condições prolongadas ou extremas podem afetar a estabilidade do produto.
Por isso, são importantes uma embalagem adequada e condições de transporte apropriadas.
Humidade residual e oxidação
A água pode influenciar indiretamente os processos oxidativos.
A oxidação é também influenciada por:
- oxigénio;
- luz;
- iões metálicos;
- temperatura;
- composição de aminoácidos.
Um baixo teor de humidade não impede completamente a oxidação.
Por isso, podem ser necessárias medidas adicionais, tais como:
- embalagem controlada;
- proteção contra a luz;
- temperatura de armazenamento adequada.
Humidade residual e desamidação
A desamidação é uma alteração química que pode afetar determinados resíduos de aminoácidos.
Sobretudo a asparagina e a glutamina podem ser sensíveis.
A velocidade de reação é influenciada por:
- água;
- temperatura;
- pH;
- sequência de aminoácidos;
- ambiente molecular.
Um aumento da mobilidade molecular pode, em determinadas condições, favorecer a desamidação.
Humidade residual e agregação
A agregação significa que as moléculas formam estruturas maiores em conjunto.
A humidade residual pode influenciar a mobilidade e a interação entre moléculas.
A relação é complexa.
Tanto um teor de humidade demasiado elevado como um teor inadequadamente baixo podem, em determinadas formulações, afetar a estabilidade física.
Por isso, a agregação é investigada separadamente.
Como é determinada uma especificação adequada para a humidade residual?
Uma especificação do produto deve basear-se, preferencialmente, em dados experimentais.
Os investigadores podem comparar lotes com diferentes valores de humidade.
Entre outros, medem-se, por exemplo:
- pureza por HPLC;
- produtos de degradação;
- agregação;
- solubilidade;
- estrutura física;
- estabilidade durante o armazenamento.
Com base nestes dados, pode ser estabelecido um intervalo aceitável.
O que pode constar de um COA?
Um certificado de análise pode conter dados como:
- teste: humidade residual;
- método: Karl Fischer;
- especificação: intervalo estabelecido;
- resultado medido;
- avaliação: conforme ou não conforme.
Nem todos os COA incluem uma análise de humidade.
Quando apenas foram realizadas HPLC e espectrometria de massa, não é possível tirar daí qualquer conclusão sobre a humidade residual.
A humidade residual é o mesmo que a pureza do péptido?
Não.
A humidade residual e a pureza por HPLC são parâmetros de qualidade diferentes.
A pureza por HPLC descreve geralmente a composição cromatográfica relativa.
A humidade residual descreve a quantidade de água no material.
Um produto pode:
- ter uma elevada pureza por HPLC;
- e um teor de humidade relativamente elevado.
Ambos os resultados podem estar corretos em simultâneo.
A humidade residual é o mesmo que o teor de péptido?
Não.
A humidade residual pode, contudo, influenciar o teor de péptido calculado.
Quando a água contribui para a massa total, a fração líquida de péptido pode ser inferior.
Por isso, a análise da humidade pode fazer parte de um balanço de massa.
Limitações científicas
Uma única medição da humidade residual não fornece uma imagem completa da estabilidade do produto.
A estabilidade real também depende de:
- sequência de aminoácidos;
- modificações químicas;
- formulação;
- oxigénio;
- luz;
- temperatura;
- embalagem;
- tempo de armazenamento.
Um valor baixo de humidade não comprova automaticamente:
- elevada pureza do péptido;
- identidade correta;
- quantidade correta de péptido;
- esterilidade;
- atividade biológica.
Para uma avaliação de qualidade mais abrangente, são necessárias análises adicionais.
Resumo
Os péptidos de investigação liofilizados geralmente não são totalmente anidros.
Após a liofilização, pode permanecer uma pequena quantidade de humidade residual.
A humidade residual pode influenciar:
- mobilidade molecular;
- estabilidade química;
- agregação;
- oxidação;
- desamidação;
- estrutura física do produto.
Os métodos analíticos utilizados com maior frequência são:
- titulação de Karl Fischer;
- perda por secagem;
- análise termogravimétrica.
A quantidade ideal de humidade residual varia consoante o péptido e a formulação.
Por conseguinte, o valor mais baixo possível não é automaticamente o ideal para todos os produtos.
A humidade residual deve ser avaliada em conjunto com:
- pureza por HPLC;
- ensaio de péptidos;
- identidade molecular;
- integridade da embalagem;
- dados de estabilidade.
Aviso de investigação
Os péptidos de investigação da Peptidera são disponibilizados exclusivamente para Research Use Only (RUO) e destinam-se a investigação laboratorial e aplicações analíticas.
Não se destina ao consumo humano ou animal, a utilização diagnóstica, a aplicações terapêuticas ou à autoadministração.
Categoria:
Conhecimentos sobre péptidos & controlo de qualidade
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Propostas de ligações internas:
- Ligação para PB-0227 no processo de liofilização
- Ligação para PB-0228 na integridade do frasco, rolha e embalagem
- Ligação para PB-0233 na humidade residual e no teor líquido de péptido
- Ligação para PB-0232 na análise de humidade de um COA
- Ligação para a página da Peptidera com certificados de análise
- Ligação para a coleção de péptidos de investigação liofilizados