Humidade residual em peptídeos liofilizados: impacto na estabilidade e qualidade

Peptídeos de pesquisa liofilizados são frequentemente fornecidos como uma estrutura seca e porosa num frasco de vidro fechado. Ao remover a maior parte da água durante o processo de liofilização, o movimento molecular e certos processos de degradação química podem ser limitados.

No entanto, liofilizado não significa automaticamente totalmente isento de água.

Após a liofilização, pode permanecer uma pequena quantidade de água no produto. Isto é chamado de humidade residual, humidade residual ou residual moisture.

A quantidade de humidade residual pode influenciar:

• estabilidade química;
• estabilidade física;
• mobilidade molecular;
• agregação;
• oxidação;
• a estrutura da matriz liofilizada;
• estabilidade durante o armazenamento.

Um teor de humidade muito elevado pode acelerar certos processos de degradação. No entanto, um teor de humidade extremamente baixo não é automaticamente ideal para todas as formulações de peptídeos. Algumas estruturas moleculares podem beneficiar de uma quantidade limitada de água ligada.

O valor desejado de humidade residual depende, portanto, do peptídeo específico, formulação, embalagem e condições de armazenamento.

Neste blog discutimos como a humidade residual se forma, como é medida e por que a análise de humidade pode ser uma parte importante da investigação de estabilidade em peptídeos de pesquisa liofilizados.

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O que é humidade residual?

Humidade residual é a quantidade de água que permanece num produto liofilizado após o processo de secagem.

Esta água pode estar localizada:

• entre moléculas;
• na superfície da estrutura liofilizada;
• em poros microscópicos;
• ligada a grupos peptídicos;
• ligada a excipientes;
• em equilíbrio com a fase gasosa no frasco.

A humidade residual é geralmente expressa como uma percentagem da massa total.

Um resultado hipotético pode ser, por exemplo:

Humidade residual: 1,8%

Isto significa que, segundo o método de medição utilizado, cerca de 1,8% da massa analisada é atribuída à água.

O significado deste valor depende de:

• especificação do produto;
• método de análise utilizado;
• propriedades do peptídeo;
• formulação;
• objetivo de armazenamento.

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Por que os peptídeos são liofilizados?

Peptídeos podem ser sensíveis a várias alterações químicas e físicas em solução aquosa.

Os processos possíveis são:

• hidrólise;
• oxidação;
• desamidação;
• agregação;
• alterações estruturais.

Ao congelar uma solução e depois remover grande parte da água sob pressão reduzida, forma-se uma matriz seca.

Este processo é chamado:

• liofilização;
• liofilização;
• liofilização.

O objetivo não é apenas remover a água.

Um processo de liofilização bem desenvolvido deve também contribuir para:

• manutenção da integridade molecular;
• formação de um bolo estável;
• qualidade do produto reproduzível;
• solubilidade adequada para análise.

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Como se forma a humidade residual?

Durante a liofilização, a água é removida em várias fases.

As principais fases do processo são:

1. congelação;
2. secagem primária;
3. secagem secundária.

Cada fase afeta a quantidade final de humidade residual.

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Fase 1: congelação

Durante a fase de congelação, a solução peptídica é arrefecida.

Uma grande parte da água forma cristais de gelo.

Outros componentes são concentrados nas partes da solução que não congelam.

A forma como o produto congela pode afetar:

• tamanho dos cristais de gelo;
• estrutura dos poros;
• tempo de secagem;
• distribuição dos componentes;
• estrutura final do produto.

Cristais de gelo maiores podem deixar poros maiores após a sublimação.

Isto pode afetar o transporte de vapor de água durante a secagem primária.

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Fase 2: secagem primária

Durante a fase de secagem primária, a pressão é reduzida.

A água congelada é então removida por sublimação.

Sublimação significa que o gelo passa diretamente do estado sólido para vapor de água.

A temperatura do produto deve ser cuidadosamente controlada durante esta fase.

Quando a temperatura fica demasiado alta, a estrutura pode colapsar.

Isto é por vezes referido como:

colapso do bolo

Uma estrutura colapsada pode afetar:

• aparência;
• porosidade;
• comportamento de secagem;
• solubilidade;
• estabilidade.

Após a fase de secagem primária, grande parte do gelo livre foi removida.

Ainda pode haver água ligada presente.

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Fase 3: secagem secundária

Durante a fase de secagem secundária, a água fortemente ligada é removida.

Isto é geralmente feito aumentando controladamente a temperatura do produto enquanto se mantém a baixa pressão.

O objetivo é reduzir a humidade residual para um valor previamente definido.

O valor final ótimo varia consoante o produto.

Uma secagem secundária demasiado curta pode levar a:

• aumento da humidade residual;
• maior mobilidade molecular;
• estabilidade reduzida.

Uma fase de secagem demasiado intensa pode também ter efeitos adversos em algumas formulações.

Por isso, o processo é desenvolvido especificamente para cada produto.

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Um peptídeo liofilizado está completamente seco?

Normalmente não.

O termo liofilizado significa que uma grande parte da água foi removida.

Não significa automaticamente que o produto contém 0% de água.

As moléculas de água podem permanecer fortemente ligadas a:

• grupos de aminoácidos polares;
• ligações peptídicas;
• sais;
• componentes da formulação.

A remoção completa pode ser tecnicamente difícil e nem sempre desejável.

Por isso, normalmente trabalha-se com um intervalo aceitável de humidade residual.

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Porque é que um excesso de humidade residual pode ser um problema?

A água pode aumentar a mobilidade molecular.

Quando as moléculas se movem mais facilmente, certas reacções químicas podem ocorrer mais rapidamente.

Um aumento do teor de humidade residual pode, em certas condições, contribuir para:

• hidrólise;
• desamidação;
• alterações oxidativas;
• agregação;
• instabilidade estrutural.

A influência depende de:

• sequência peptídica;
• temperatura;
• oxigénio;
• luz;
• microambiente de pH;
• tempo de armazenamento.

A humidade residual é, portanto, um factor de estabilidade e deve ser avaliada juntamente com outras condições.

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O que é mobilidade molecular?

Numa matriz liofilizada seca, as moléculas têm movimentos relativamente limitados.

A água pode funcionar como um plastificante molecular.

Isto pode aumentar os movimentos moleculares.

Uma maior mobilidade pode aumentar a probabilidade de grupos reactivos se encontrarem.

Isto pode influenciar certas reacções de degradação.

No entanto, a relação entre o teor de água e a estabilidade nem sempre é linear.

Mais água não significa necessariamente mais degradação em todas as circunstâncias.

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Pode um teor de humidade extremamente baixo ser também prejudicial?

Sim, isso é possível.

Um teor de humidade muito baixo não é automaticamente o ideal para todos os peptídeos.

Uma quantidade limitada de água ligada pode contribuir para:

• manutenção de certas interacções moleculares;
• estabilização da estrutura;
• redução da tensão mecânica.

A secagem excessiva pode causar alterações em algumas formulações em:

• estrutura molecular;
• matriz do produto;
• solubilidade.

O valor desejado de humidade residual deve, portanto, ser determinado experimentalmente.

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O que é um bolo liofilizado?

Após a liofilização, geralmente permanece uma estrutura sólida porosa.

Este é frequentemente chamado de bolo liofilizado.

Um bolo bem formado pode ter características como:

• estrutura uniforme;
• porosidade suficiente;
• retracção limitada;
• sem colapso visível.

No entanto, a aparência não fornece informação completa sobre a qualidade.

Um bolo visualmente limpo pode ainda assim ter um teor de humidade anormal.

Por outro lado, uma forma anormal não significa automaticamente que a qualidade molecular é insuficiente.

A avaliação analítica continua a ser necessária.

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Pode indicar a humidade residual exterior?

Não.

A humidade residual não pode ser determinada de forma fiável apenas olhando para o frasco.

As possíveis alterações exteriores são:

• retracção;
• colapso;
• pegajosidade;
• descoloração;
• alteração da estrutura.

Estes fenómenos podem ter várias causas.

Para a determinação quantitativa é necessário um método de análise adequado.

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Como é medida a umidade residual?

Podem ser usadas várias técnicas.

Métodos muito usados são:

• titulação de Karl Fischer;
• análise termogravimétrica;
• perda por secagem;
• métodos espectroscópicos.

Cada método mede a umidade de uma forma diferente.

Por isso, os resultados nem sempre são diretamente intercambiáveis.

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O que é titulação de Karl Fischer?

A titulação de Karl Fischer é um método muito utilizado para determinação de água.

O método utiliza uma reação química que é especificamente sensível à água.

A quantidade de reagente consumido é usada para calcular o teor de água.

A análise de Karl Fischer pode ser adequada para baixas concentrações de umidade.

Existem diferentes versões:

• titulação de Karl Fischer volumétrica;
• titulação de Karl Fischer coulométrica.

O método adequado depende da quantidade de água e do tipo de amostra.

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Análise de Karl Fischer coulométrica

A titulação de Karl Fischer coulométrica é frequentemente usada para pequenas quantidades de água.

Durante a análise, o reagente necessário é formado eletroquimicamente.

A quantidade de carga elétrica é usada para calcular o teor de água.

Possíveis vantagens são:

• sensibilidade;
• adequação para baixos valores de umidade;
• pequenas quantidades de amostra.

A confiabilidade depende de:

• preparação da amostra;
• extração completa de água;
• equipamento;
• calibração;
• correção de fundo.

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O que é perda por secagem?

Na perda por secagem, abreviada LOD, uma amostra é pesada antes e depois da secagem controlada.

A perda de massa é calculada.

Este método nem sempre mede exclusivamente água.

Outros componentes voláteis também podem desaparecer durante o processo de secagem.

Por isso, perda por secagem não é automaticamente igual a uma determinação específica de água.

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O que é análise termogravimétrica?

Análise termogravimétrica é abreviada como TGA.

Durante a TGA, a massa de uma amostra é medida enquanto a temperatura é controladamente alterada.

A perda de massa pode fornecer informações sobre:

• umidade;
• componentes voláteis;
• alterações térmicas.

A interpretação requer conhecimento de:

• perfil de temperatura;
• composição do produto;
• possíveis processos de decomposição.

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Por que o método de medição pode fazer diferença?

Nem todos os métodos detectam a água da mesma forma.

Algumas técnicas medem:

• água específica;
• perda total de massa;
• água livre;
• água ligada.

Por isso, diferentes métodos podem fornecer valores diferentes.

Um resultado de umidade residual deve sempre ser avaliado juntamente com:

• método;
• condições de medição;
• especificação do produto.

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Qual é o papel da rolha de borracha?

Na liofilização, o frasco deve ser bem fechado.

A rolha de borracha forma uma barreira importante contra a humidade do ambiente.

A proteção depende de:

• material da rolha;
• fecho;
• colocação;
• compatibilidade;
• tempo de armazenamento.

Um frasco mal fechado pode absorver humidade.

Por isso, a integridade da embalagem é importante para a estabilidade.

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Qual é o papel da tampa de alumínio?

A tampa de alumínio mantém mecanicamente a rolha de borracha no lugar.

Um fecho correto apoia:

• integridade do fecho;
• proteção contra movimento da rolha;
• fecho consistente.

Uma tampa de alumínio danificada ou solta pode justificar uma inspeção adicional.

No entanto, a aparência por si só não prova que o fecho é completamente hermético.

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A humidade pode penetrar através dos materiais de embalagem?

Os materiais de embalagem formam barreiras, mas nenhum sistema é absolutamente impermeável em todas as condições.

Os possíveis fatores são:

• tipo de material;
• duração do armazenamento;
• temperatura;
• humidade do ar;
• qualidade do fecho.

A exposição prolongada a alta humidade do ar pode aumentar a probabilidade de absorção de humidade quando a barreira da embalagem é insuficiente.

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O que é a integridade do fecho do recipiente?

A integridade do fecho do recipiente descreve o grau em que o frasco, a rolha e a tampa de alumínio formam um fecho protetor conjunto.

Isto é frequentemente abreviado para:

CCI

A investigação da integridade da embalagem pode focar-se em:

• vazamento;
• troca gasosa;
• penetração de humidade;
• danos mecânicos.

Um bom fecho ajuda a manter o ambiente interno.

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Qual é a influência da temperatura de armazenamento?

A temperatura pode influenciar:

• movimento molecular;
• reações químicas;
• migração de humidade;
• estabilidade física.

Temperaturas mais elevadas podem acelerar certos processos de degradação.

A humidade residual e a temperatura podem influenciar-se mutuamente.

Um produto com maior humidade residual pode alterar-se mais rapidamente a temperaturas mais elevadas do que em condições controladas e mais frescas.

A estabilidade real deve ser investigada experimentalmente.

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Por que a humidade do ar é importante?

Quando um frasco é aberto ou não está devidamente fechado, a humidade ambiental pode influenciar.

O grau de absorção de humidade depende de:

• humidade relativa do ar;
• duração da exposição;
• higroscopicidade;
• estrutura do produto.

Alguns materiais liofilizados atraem humidade mais facilmente do que outros.

Isto é chamado de higroscopicidade.

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O que significa higroscópico?

Um material higroscópico tende a atrair água do ambiente.

As possíveis consequências são:

• maior teor de humidade;
• alteração da estrutura do bolo;
• pegajosidade;
• maior mobilidade molecular.

O grau de higroscopicidade depende da composição do produto.

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O transporte pode influenciar?

O transporte pode expor o produto a:

• flutuações de temperatura;
• vibrações;
• variações de pressão;
• humidade do ar variável.

Quando o frasco está bem fechado, a absorção direta de humidade é limitada.

No entanto, condições prolongadas ou extremas podem afetar a estabilidade do produto.

Por isso, embalagens e condições de transporte adequadas são importantes.

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Humidade residual e oxidação

A água pode influenciar indiretamente os processos oxidativos.

A oxidação é também influenciada por:

• oxigénio;
• luz;
• íon metálico;
• temperatura;
• composição de aminoácidos.

Um teor baixo de humidade não previne completamente a oxidação.

Por isso, podem ser necessárias medidas adicionais, tais como:

• embalagem controlada;
• proteção contra luz;
• temperatura de armazenamento adequada.

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Humidade residual e desamidificação

Desamidificação é uma alteração química que pode afetar certos resíduos de aminoácidos.

Principalmente asparagina e glutamina podem ser sensíveis.

A velocidade da reação é influenciada por:

• água;
• temperatura;
• pH;
• sequência de aminoácidos;
• ambiente molecular.

Uma mobilidade molecular aumentada pode, em certas condições, favorecer a desamidificação.

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Humidade residual e agregação

Agregação significa que moléculas se juntam formando estruturas maiores.

A humidade residual pode influenciar a mobilidade e interação entre moléculas.

A relação é complexa.

Tanto um teor de humidade demasiado elevado como demasiado baixo pode afetar a estabilidade física em certas formulações.

Por isso, a agregação é investigada separadamente.

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Como se determina uma especificação adequada para a humidade residual?

Uma especificação do produto deve preferencialmente basear-se em dados experimentais.

Os investigadores podem comparar lotes com diferentes valores de humidade.

Por exemplo, são medidos:

• pureza por HPLC;
• produtos de degradação;
• agregação;
• solubilidade;
• estrutura física;
• estabilidade durante o armazenamento.

Com base nesses dados, pode ser estabelecido um intervalo aceitável.

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O que pode constar num COA?

Um certificado de análise pode conter dados como:

• teste: humidade residual;
• método: Karl Fischer;
• especificação: intervalo estabelecido;
• resultado medido;
• avaliação: conforme ou não conforme.

Nem todos os COA contêm uma análise de humidade.

Quando apenas HPLC e espectrometria de massa são realizadas, não se pode tirar conclusões sobre a humidade residual.

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Humidade residual é o mesmo que pureza peptídica?

Não.

Humidade residual e pureza por HPLC são parâmetros de qualidade diferentes.

Pureza por HPLC geralmente descreve a composição cromatográfica relativa.

Humidade residual descreve a quantidade de água no material.

Um produto pode:

• ter alta pureza por HPLC;
• e um teor de humidade relativamente elevado.

Ambos os resultados podem estar corretos ao mesmo tempo.

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A humidade residual é o mesmo que o teor de peptídeos?

Não.

A humidade residual pode influenciar o teor calculado de peptídeos.

Quando a água contribui para a massa total, a proporção líquida de peptídeos pode ser menor.

Por isso, a análise de humidade pode fazer parte de um balanço de massa.

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Limitações científicas

Uma única medição de humidade residual não fornece uma visão completa da estabilidade do produto.

A estabilidade real também depende de:

• sequência de aminoácidos;
• modificações químicas;
• formulação;
• oxigénio;
• luz;
• temperatura;
• embalagem;
• tempo de armazenamento.

Um valor baixo de humidade não prova automaticamente:

• alta pureza de peptídeos;
• identidade correta;
• quantidade correta de peptídeos;
• esterilidade;
• atividade biológica.

Para uma avaliação de qualidade mais ampla, são necessárias análises adicionais.

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Resumo

Peptídeos de pesquisa liofilizados geralmente não estão completamente isentos de água.

Após a liofilização, pode permanecer uma pequena quantidade de humidade residual.

A humidade residual pode afetar:

• mobilidade molecular;
• estabilidade química;
• agregação;
• oxidação;
• desamidação;
• estrutura física do produto.

Métodos analíticos comuns incluem:

• titulação de Karl Fischer;
• perda por secagem;
• análise termogravimétrica.

A quantidade ótima de humidade residual varia consoante o peptídeo e a formulação.

Um valor o mais baixo possível não é automaticamente o ideal para todos os produtos.

A humidade residual deve ser avaliada em conjunto com:

• pureza por HPLC;
• ensaio de peptídeos;
• identidade molecular;
• integridade da embalagem;
• dados de estabilidade.

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Aviso de pesquisa

Os peptídeos de pesquisa da Peptidera são oferecidos exclusivamente para Research Use Only (RUO) e destinam-se a investigação laboratorial e aplicações analíticas.

Não destinado ao consumo humano ou animal, uso diagnóstico, aplicação terapêutica ou autoadministração.

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Categoria:
Conhecimento sobre peptídeos & controlo de qualidade

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