Estudo de estabilidade em peptídeos explicado
Estudos de estabilidade de péptidos: estabilidade em tempo real e testes de estabilidade acelerados
A qualidade de um péptido de investigação não é determinada apenas no momento da produção. Também é importante a forma como o material evolui durante o armazenamento.
Um péptido pode cumprir especificações previamente estabelecidas para:
- identidade;
- HPLC-zuiverheid;
- teor de péptido;
- restvocht;
- uiterlijk;
- massa molecular.
No entanto, estas propriedades podem alterar-se ao longo do tempo.
As possíveis alterações incluem:
- oxidatie;
- deamidatie;
- hydrolyse;
- aggregatie;
- verandering van restvocht;
- diminuição da pureza química;
- vorming van degradatieproducten;
- alteração da estrutura liofilizada.
Para investigar sistematicamente estas alterações, são realizados estudos de estabilidade.
Existem duas formas principais:
- estudo de estabilidade em tempo real;
- estudo de estabilidade acelerado.
Num estudo em tempo real, um produto é acompanhado durante um período prolongado nas condições de armazenamento pretendidas. Nos testes de estabilidade acelerados, o produto é temporariamente exposto a condições mais exigentes, por exemplo, a uma temperatura mais elevada.
Ambas as formas de estudo fornecem informações diferentes. Os testes acelerados podem tornar visíveis mais rapidamente possíveis vias de degradação, enquanto os dados em tempo real mostram mais diretamente como um produto evolui nas condições de armazenamento investigadas.
Neste artigo, abordamos como são estruturados os estudos de estabilidade de péptidos, quais os métodos analíticos que podem ser utilizados e por que razão um único resultado analítico não é suficiente para estabelecer a estabilidade a longo prazo.
O que é um estudo de estabilidade de péptidos?
Um estudo de estabilidade é um processo científico controlado no qual as propriedades de um péptido são acompanhadas durante um determinado período.
O objetivo é investigar:
- que alterações ocorrem;
- com que rapidez ocorrem alterações;
- quais os fatores de armazenamento que têm influência;
- durante quanto tempo determinadas características de qualidade se mantêm;
- qual a embalagem e as condições de armazenamento adequadas.
Um estudo de estabilidade é geralmente composto por vários momentos de medição.
Em cada momento de medição, os parâmetros de qualidade previamente selecionados são novamente analisados.
Por que razão é importante uma medição inicial?
Um estudo de estabilidade começa geralmente com uma análise no início do estudo.
Esta medição é frequentemente designada por:
- T0;
- teste inicial;
- medição inicial;
- análise inicial.
A medição T0 constitui o ponto de referência para os resultados posteriores.
Quando, por exemplo, é observado um pico secundário adicional na HPLC após seis meses, o resultado pode ser comparado com o cromatograma original.
Sem uma medição inicial fiável, é mais difícil determinar:
- quais os componentes que já estavam presentes;
- que alterações ocorreram durante o armazenamento;
- qual é a dimensão da alteração.
O que é um estudo de estabilidade em tempo real?
Num estudo de estabilidade em tempo real, um produto é armazenado durante um período prolongado nas condições de armazenamento que estão efetivamente a ser investigadas.
O produto é analisado em momentos previamente definidos.
Os possíveis momentos de medição incluem, por exemplo:
- T0;
- três meses;
- seis meses;
- nove meses;
- doze meses;
- dezoito meses;
- vinte e quatro meses.
A duração exata depende de:
- objetivo do estudo;
- especificação do produto;
- propriedades do péptido;
- condições de armazenamento;
- dados disponíveis.
O estudo em tempo real requer tempo, mas fornece informação direta sobre as alterações nas condições investigadas.
O que é a análise de estabilidade acelerada?
Na análise de estabilidade acelerada, um produto é temporariamente exposto a condições mais severas.
Voorbeelden zijn:
- temperatura mais elevada;
- humidade do ar elevada;
- exposição mais intensa à luz;
- variações repetidas de temperatura.
O objetivo é tornar mais visíveis, mais rapidamente, os potenciais processos de degradação.
Uma alteração que surge lentamente em condições normais pode, sob uma temperatura elevada, ser detetada mais rapidamente.
Os testes de estabilidade acelerada podem ser úteis para:
- desenvolvimento inicial do produto;
- comparação de formulações;
- avaliação das embalagens;
- identificação das vias de degradação;
- seleção das condições de armazenamento.
Um teste acelerado pode prever exatamente o período de armazenamento real?
Nem sempre.
Os dados de estabilidade acelerada podem fornecer indicações, mas não equivalem automaticamente aos resultados em tempo real.
Alguns processos de degradação reagem de forma diferente à:
- temperatura;
- humidade;
- oxigénio;
- luz.
A uma temperatura mais elevada pode, por exemplo, surgir uma via de degradação que seja pouco relevante em condições normais de armazenamento.
Por isso, os dados de estabilidade acelerada são preferencialmente combinados com estudos de estabilidade em tempo real.
Que influência tem a temperatura?
A temperatura influencia a velocidade de muitas reações químicas.
A temperaturas mais elevadas, o movimento molecular aumenta.
Isto pode acelerar determinados processos, como:
- oxidatie;
- deamidatie;
- hydrolyse;
- aggregatie;
- isomerização.
A sensibilidade varia consoante o péptido.
Uma exposição breve a uma temperatura mais elevada não equivale automaticamente a um armazenamento prolongado a uma temperatura mais baixa.
A influência total depende de:
- temperatura;
- blootstellingsduur;
- formulering;
- teor de humidade;
- sequência do péptido.
O que é a relação de Arrhenius?
A relação de Arrhenius é um modelo científico que descreve como a velocidade de determinadas reações químicas varia com a temperatura.
De forma simplificada:
A uma temperatura mais elevada, muitas reações químicas podem ocorrer mais rapidamente.
Com dados de várias temperaturas, pode por vezes elaborar-se um modelo para comparar as velocidades das reações.
Isto requer:
- pontos de medição suficientes;
- uma reação de degradação adequada;
- métodos analíticos fiáveis;
- cinética de reação consistente.
Nem todas as alterações nos péptidos seguem um único modelo de Arrhenius simples.
Por isso, as previsões devem ser interpretadas cuidadosamente.
Que influência tem a humidade do ar?
A humidade do ar pode ser particularmente relevante para produtos liofilizados e sistemas de embalagem.
Quando a humidade penetra no frasco, o teor de humidade residual pode aumentar.
Isto pode influenciar:
- moleculaire mobiliteit;
- reações hidrolíticas;
- deamidatie;
- estrutura física;
- agregação.
O grau de proteção depende de:
- frasco de vidro;
- rolha de borracha;
- cápsula de alumínio cravada;
- integridade da embalagem;
- duração do armazenamento.
Um selamento intacto ajuda a proteger o ambiente interno.
Welke invloed heeft licht?
Licht kan fotochemische reacties veroorzaken.
Vooral ultraviolet licht kan invloed hebben op gevoelige aminozuurresiduen.
Mogelijke lichtgevoelige aminozuren zijn:
- tryptofaan;
- tyrosine;
- cysteïne;
- methionine.
Licht kan bijdragen aan:
- oxidatie;
- vorming van degradatieproducten;
- structurele veranderingen.
Daarom kunnen fotostabiliteitstests worden uitgevoerd.
Wat is fotostabiliteitsonderzoek?
Bij fotostabiliteitsonderzoek wordt een monster gecontroleerd blootgesteld aan licht.
Daarna worden mogelijke veranderingen onderzocht.
De analyse kan gericht zijn op:
- HPLC-profiel;
- moleculaire massa;
- kleur;
- uiterlijk;
- degradatieproducten.
De testcondities moeten worden vastgelegd, waaronder:
- lichtintensiteit;
- golflengtegebied;
- blootstellingsduur;
- temperatuur.
Welke invloed heeft zuurstof?
Zuurstof kan bijdragen aan oxidatieve degradatie.
De invloed hangt af van:
- aminozuursequentie;
- zuurstofconcentratie;
- temperatura;
- luz;
- humidade;
- aanwezigheid van metaalionen.
Oxidatiegevoelige aminozuren zijn onder andere:
- methionine;
- cysteïne;
- tryptofaan;
- tyrosine.
Verpakking en afsluiting kunnen invloed hebben op de blootstelling aan zuurstof.
Stabiliteit van gevriesdroogde peptiden
Lyofilisatie wordt gebruikt om een groot deel van het water uit een peptideformulering te verwijderen.
Hierdoor kunnen bepaalde degradatieprocessen worden vertraagd.
Een gevriesdroogd peptide is echter niet automatisch onbeperkt stabiel.
Mogelijke veranderingen tijdens droge opslag zijn:
- oxidatie;
- deamidatie;
- verandering van restvocht;
- aggregatie;
- structurele veranderingen in de cake.
De stabiliteit hangt af van:
- peptide;
- formulering;
- restvocht;
- temperatura;
- embalagem;
- duração do armazenamento.
Stabiliteit in oplossing
Na het oplossen verandert de moleculaire omgeving.
Het peptide wordt blootgesteld aan een waterige fase waarin moleculen meer bewegingsvrijheid hebben.
De stabiliteit kan worden beïnvloed door:
- pH;
- temperatura;
- concentratie;
- oplosmiddel;
- oxigénio;
- luz;
- ionsterkte;
- duração do armazenamento.
Stabiliteitsgegevens van een gevriesdroogd peptide kunnen daarom niet automatisch worden toegepast op hetzelfde peptide in oplossing.
Beide vormen moeten afzonderlijk worden onderzocht.
Welke kwaliteitsparameters worden gemeten?
De gekozen analyses hangen af van het peptide en het onderzoeksdoel.
Mogelijke parameters zijn:
- uiterlijk;
- HPLC-zuiverheid;
- moleculaire identiteit;
- ensaio de péptidos;
- degradatieproducten;
- aggregatie;
- restvocht;
- oplosbaarheid;
- pH;
- verpakkingsintegriteit.
Niet iedere stabiliteitsstudie bevat alle mogelijke tests.
HPLC tijdens stabiliteitsonderzoek
HPLC is een veelgebruikte methode voor het volgen van chemische veranderingen.
Tijdens opslag kunnen nieuwe nevenpieken ontstaan.
Onderzoekers kunnen beoordelen:
- afname van de hoofdpiek;
- toename van bestaande nevenpieken;
- vorming van nieuwe pieken;
- verandering van retentietijd.
Een nieuwe piek geeft aan dat een andere chromatografische component aanwezig kan zijn.
De identiteit van deze component moet eventueel met aanvullende technieken worden onderzocht.
LC-MS tijdens stabiliteitsonderzoek
LC-MS combineert chromatografische scheiding met massaspectrometrie.
De techniek kan helpen bij het onderzoeken van:
- oxidatie;
- deamidatie;
- hydrolyse;
- fragmentatie;
- andere massaveranderingen.
Een massaverschil kan informatie geven over een mogelijke degradatieroute.
Voor exacte lokalisatie kan tandem-massaspectrometrie nodig zijn.
Onderzoek naar aggregatie
Chemische zuiverheid en fysieke stabiliteit zijn niet hetzelfde.
Daarom kan aggregatie afzonderlijk worden onderzocht.
Mogelijke technieken zijn:
- size-exclusionchromatografie;
- dynamische lichtverstrooiing;
- deeltjesanalyse;
- analytische ultracentrifugatie.
Een heldere oplossing sluit de aanwezigheid van kleine aggregaten niet volledig uit.
Restvocht tijdens stabiliteitsonderzoek
Bij gelyofiliseerde peptiden kan het restvocht in de loop van de tijd worden gevolgd.
Een verandering kan wijzen op:
- vochtopname;
- verandering in de verpakkingsbarrière;
- invloed van opslagcondities.
Karl Fischer-titratie is een veelgebruikte methode voor specifieke waterbepaling.
Restvocht kan invloed hebben op:
- moleculaire mobiliteit;
- chemische stabiliteit;
- fysieke productstructuur.
Waarom is een peptide-assay belangrijk?
Een HPLC-zuiverheidspercentage beschrijft niet automatisch hoeveel peptide aanwezig is.
Daarom kan tijdens stabiliteitsonderzoek ook een kwantitatieve assay worden uitgevoerd.
De assay kan informatie geven over:
- hoeveelheid intact peptide;
- verandering in het peptidegehalte;
- massabalans.
Mogelijke methoden zijn:
- kwantitatieve HPLC;
- aminozuuranalyse;
- LC-MS-kwantificering;
- andere gevalideerde methoden.
Wat is een stabiliteitsindicerende analysemethode?
Een stabiliteitsindicerende methode kan het oorspronkelijke peptide voldoende onderscheiden van relevante degradatieproducten.
Een geschikte methode moet bijvoorbeeld kunnen aantonen:
- afname van de oorspronkelijke component;
- vorming van nieuwe componenten;
- verandering tijdens opslag.
Niet elke standaard-HPLC-methode is automatisch stabiliteitsindicerend.
De methode moet aantoonbaar geschikt zijn voor het onderzoeksdoel.
Wat is geforceerde degradatie?
Bij geforceerde degradatie wordt een peptide bewust blootgesteld aan belastende omstandigheden.
Voorbeelden zijn:
- verhoogde temperatuur;
- oxidatieve omstandigheden;
- zure omstandigheden;
- basische omstandigheden;
- blootstelling aan licht.
Het doel is mogelijke degradatieproducten te genereren.
Hiermee kan worden onderzocht of een analysemethode:
- het oorspronkelijke peptide herkent;
- degradatieproducten scheidt;
- veranderingen betrouwbaar detecteert.
Geforceerde degradatie is niet hetzelfde als een normale houdbaarheidsstudie.
Wat is een stabiliteitsspecificatie?
Een stabiliteitsspecificatie beschrijft vooraf vastgelegde aanvaardingscriteria.
Mogelijke criteria zijn:
- minimale HPLC-zuiverheid;
- maximaal toegestane hoeveelheid degradatieproduct;
- toegestaan bereik voor restvocht;
- peptidegehalte binnen een bepaald bereik;
- aanvaardbaar uiterlijk.
De criteria moeten wetenschappelijk onderbouwd zijn.
Waarom zijn meerdere batches belangrijk?
Eén batch geeft beperkte informatie over procesvariatie.
Door meerdere batches te onderzoeken kan worden beoordeeld:
- of de stabiliteit reproduceerbaar is;
- of batches vergelijkbaar reageren;
- hoeveel variatie aanwezig is.
Os resultados específicos de cada lote devem estar associados a números de lote claros.
Que papel desempenha a embalagem?
A embalagem protege o produto contra influências ambientais.
Os componentes principais são:
- frasco de vidro;
- rolha de borracha;
- cápsula de alumínio cravada.
A embalagem pode influenciar:
- entrada de humidade;
- exposição ao oxigénio;
- exposição à luz;
- proteção física.
Por isso, a estabilidade é estudada na embalagem final em que o material é armazenado.
O que é a integridade do fecho do recipiente?
A integridade do fecho do recipiente, abreviada como CCI, descreve a qualidade do fecho.
Um bom sistema de fecho ajuda a proteger contra:
- humidade;
- trocas gasosas;
- fugas;
- contaminação externa.
A CCI é um parâmetro de qualidade independente e pode ser estudada através de métodos específicos.
Que influência tem o transporte?
O transporte pode provocar:
- variações de temperatura;
- vibrações;
- stress mecânico;
- exposição temporária ao calor.
Por isso, podem ser utilizados estudos de transporte ou perfis de temperatura.
Uma breve variação de temperatura não pode ser avaliada automaticamente sem dados de estabilidade específicos do produto.
O que é o mapeamento da temperatura?
O mapeamento da temperatura analisa como as temperaturas se distribuem no interior de um sistema de armazenamento ou transporte.
Isto pode ser aplicado a:
- armazenamento refrigerado;
- armazéns;
- embalagens de transporte;
- rotas de transporte.
Os registadores de dados podem registar a temperatura ao longo do tempo.
Os resultados fornecem informações sobre possíveis variações de temperatura.
Como ler os dados de estabilidade?
Nos dados de estabilidade, verifique pelo menos:
- Que péptido foi estudado?
- Que número de lote foi utilizado?
- Que condições de armazenamento foram aplicadas?
- Que embalagem foi utilizada?
- Quanto tempo durou o estudo?
- Que momentos de medição foram utilizados?
- Que métodos analíticos foram utilizados?
- Que especificações foram aplicadas?
Uma afirmação isolada como “estável durante doze meses” tem uma interpretabilidade limitada sem este contexto.
Por que motivo é importante a data da análise?
A data da análise indica quando foi efetuada a medição.
Num estudo da estabilidade, deve ser claro:
- quando começou o armazenamento;
- quando ocorreu cada momento de medição;
- que período de tempo foi estudado.
Sem dados temporais, não é possível acompanhar de forma fiável o desenvolvimento do produto.
Limitações científicas
Os dados de estabilidade aplicam-se apenas às condições estudadas.
Os resultados não podem ser automaticamente aplicados a:
- outros péptidos;
- outros lotes;
- outras formulações;
- outras embalagens;
- outras temperaturas;
- outra duração de armazenamento.
Os testes de estabilidade acelerada também nem sempre preveem exatamente o comportamento de um produto durante um armazenamento prolongado em tempo real.
Por isso, a análise direta em tempo real continua a ser importante.
Resumo
O estudo da estabilidade analisa como a qualidade de um péptido se altera durante o armazenamento.
As duas formas principais são:
- estudo da estabilidade em tempo real;
- análise acelerada da estabilidade.
Os principais fatores de influência são:
- temperatura;
- humidade;
- luz;
- oxigénio;
- embalagem;
- duração do armazenamento.
As análises possíveis incluem:
- HPLC;
- LC-MS;
- ensaio de péptidos;
- análise da agregação;
- análise da humidade residual;
- estudo da integridade da embalagem.
Os estudos em tempo real fornecem informações diretas sobre as condições de armazenamento investigadas.
Os testes acelerados podem tornar visíveis mais rapidamente possíveis vias de degradação, mas não substituem totalmente os dados de estabilidade em tempo real.
Uma avaliação fiável da estabilidade requer informações claras sobre o lote, condições de armazenamento controladas, vários momentos de medição e métodos analíticos adequados e indicadores de estabilidade.
Declaração de isenção de responsabilidade relativa à investigação
Os péptidos para investigação da Peptidera são disponibilizados exclusivamente para Research Use Only (RUO) e destinam-se a investigação laboratorial e aplicações analíticas.
Não se destina ao consumo humano ou animal, a utilização diagnóstica, aplicações terapêuticas ou autoadministração.
Categoria:
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