Analiza aminoacizilor la peptide explicată
Analiza aminoacizilor în cazul peptidelor: compoziția și cuantificarea explicate
Peptidele sunt formate din lanțuri de aminoacizi. Ordinea acestor aminoacizi determină o mare parte a proprietăților chimice și structurale ale unei peptide.
În analiza calității, tehnici precum HPLC și spectrometria de masă sunt utilizate frecvent pentru evaluarea purității și a masei moleculare. O metodă analitică suplimentară este analiza aminoacizilor, abreviată adesea AAA.
Analiza aminoacizilor poate fi utilizată pentru a examina:
- ce aminoacizi sunt prezenți într-o probă;
- în ce măsură proporțiile de aminoacizi măsurate corespund compoziției așteptate;
- câtă peptidă este prezentă;
- dacă compoziția aminoacidică corespunde peptidei teoretice;
- cum poate fi calculat conținutul net de peptide.
Metoda funcționează diferit față de HPLC și spectrometria de masă. În analiza clasică a aminoacizilor, lanțul peptidic este mai întâi descompus în aminoacizi individuali. Apoi, acești aminoacizi sunt separați, detectați și cuantificați.
Analiza aminoacizilor poate oferi informații valoroase, dar are și limitări. În timpul descompunerii, unii aminoacizi se pot modifica parțial sau se pot pierde. Prin urmare, rezultatele trebuie întotdeauna interpretate în contextul metodei utilizate.
Ce este analiza aminoacizilor?
Analiza aminoacizilor este o tehnică de laborator prin care este examinată compoziția aminoacidică a unei probe.
Într-o analiză clasică, se efectuează de obicei următorii pași:
- pregătirea probei;
- hidroliza lanțului peptidic;
- eliberarea aminoacizilor individuali;
- separarea aminoacizilor;
- detectare și cuantificare;
- comparație cu compoziția așteptată.
Rezultatul poate fi exprimat ca:
- cantitatea fiecărui aminoacid;
- raportul molar;
- concentrația masică;
- profilul aminoacizilor;
- conținutul calculat de peptide.
Ce este hidroliza?
Hidroliza este un proces chimic în care legăturile sunt descompuse cu ajutorul apei.
În analiza aminoacizilor, legăturile peptidice sunt descompuse, astfel încât aminoacizii individuali sunt eliberați.
O metodă utilizată frecvent este hidroliza acidă.
În acest proces, proba este expusă timp de o perioadă controlată la:
- acid puternic;
- temperatură ridicată;
- condiții controlate.
După hidroliză, lanțul peptidic inițial nu mai există ca moleculă intactă.
Aminoacizii eliberați pot fi apoi analizați individual.
De ce este descompus lanțul peptidic?
O peptid intact poate conține zeci de reziduuri diferite de aminoacizi.
Prin descompunerea lanțului, poate fi măsurată cantitatea totală a fiecărui aminoacid.
Să presupunem că o peptidă teoretică conține:
- patru reziduuri de alanină;
- două reziduuri de glicină;
- trei reziduuri de leucină;
- un reziduu de tirozină.
După hidroliză, se poate verifica dacă proporțiile măsurate corespund aproximativ acestei compoziții teoretice.
Acest lucru susține evaluarea compoziției aminoacizilor.
Care este diferența dintre compoziția aminoacizilor și secvența aminoacizilor?
Analiza aminoacizilor măsoară în principal ce aminoacizi sunt prezenți și în ce cantitate.
Metoda nu determină automat ordinea exactă.
Două peptide diferite pot avea aceeași compoziție de aminoacizi, dar o ordine diferită.
De exemplu:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Ambele conțin:
- o alanină;
- o glicină;
- o leucină.
Totuși, secvența este diferită.
Pentru analiza secvenței sunt necesare alte tehnici, precum:
- spectrometrie de masă în tandem;
- analiza fragmentelor;
- metode specifice de secvențiere.
Poate analiza aminoacizilor confirma identitatea?
Analiza aminoacizilor poate susține compoziția preconizată.
Atunci când profilul aminoacizilor măsurat diferă semnificativ de compoziția teoretică, acest lucru poate justifica investigații suplimentare.
Totuși, un profil corespunzător nu dovedește de unul singur că secvența exactă de aminoacizi este corectă.
Pentru o evaluare mai amplă a identității, pot fi combinate:
- masa moleculară;
- LC-MS;
- MS/MS;
- analiza aminoacizilor;
- date cromatografice.
Cum sunt separați aminoacizii?
După hidroliză, proba conține un amestec de aminoacizi liberi.
Aceștia trebuie separați analitic unii de alții.
Tehnicile posibile includ:
- cromatografie prin schimb ionic;
- HPLC;
- UPLC;
- electroforeză capilară.
Tehnica aleasă depinde de:
- sensibilitatea dorită;
- metoda de laborator;
- tipul de probă;
- precizia necesară.
Ce este derivatizarea?
Mulți aminoacizi au o detectabilitate limitată fără tratament suplimentar.
Prin urmare, ei pot fi legați chimic de o grupă detectabilă.
Acest proces se numește derivatizare.
Derivatizarea poate avea loc:
- înainte de separarea cromatografică;
- după separarea cromatografică.
Derivații formați pot fi măsurați mai bine, de exemplu, prin:
- detecție UV;
- detecție fluorescentă;
- spectrometrie de masă.
Derivatizare precoloană
În derivatizarea precoloană, aminoacizii sunt marcați înainte de separarea cromatografică.
Apoi, derivații formați sunt separați printr-o coloană.
Avantajele posibile includ:
- sensibilitate ridicată;
- detecție fluorescentă adecvată;
- analiza mai multor aminoacizi.
Reacția trebuie să se desfășoare reproductibil.
Derivatizarea incompletă poate influența cuantificarea.
Derivatizare post-coloană
În derivatizarea post-coloană, aminoacizii sunt mai întâi separați.
După coloană, aceștia reacționează cu un reactiv de detecție.
Un exemplu cunoscut este analiza cu ninhidrină.
Produșii de reacție formați pot fi apoi măsurați optic.
Cum se determină cantitatea de aminoacid?
Pentru cuantificare se utilizează standarde de referință.
Soluțiile standard conțin cantități cunoscute de aminoacizi.
Acestea sunt măsurate pentru a stabili o relație între:
- concentrație;
- semnalul detectorului.
Apoi se măsoară proba necunoscută.
Cu ajutorul datelor de calibrare, poate fi calculată cantitatea fiecărui aminoacid.
Ce este un standard intern?
Un standard intern este o substanță cunoscută, adăugată probelor și soluțiilor de calibrare.
Acesta poate ajuta la corectarea variațiilor din timpul:
- pregătirea probei;
- injectare;
- derivatizarea;
- analiză.
Standardul intern trebuie să se distingă bine din punct de vedere analitic de aminoacizii analizați.
Cum poate determina analiza aminoacizilor conținutul de peptide?
Când compoziția de aminoacizi a unei peptide este cunoscută, aminoacizii selectați pot fi utilizați pentru calcularea cantității de peptidă.
Să presupunem că fiecare lanț peptidic conține exact patru reziduuri de alanină.
Când se măsoară cantitatea totală de alanină, se poate estima câte lanțuri peptidice au fost prezente.
Calculul ține cont de:
- numărul de reziduuri per peptidă;
- masa moleculară;
- cantitatea măsurată de aminoacid;
- metoda de analiză.
Acest lucru poate fi utilizat pentru o analiză cantitativă a peptidelor.
De ce nu sunt utilizați întotdeauna toți aminoacizii?
Nu orice aminoacid este la fel de potrivit pentru cuantificare.
Unii aminoacizi pot suferi, în timpul hidrolizei:
- degradare parțială;
- modificare chimică;
- eliberare incompletă;
- pot fi măsurați cu dificultate și în mod fiabil.
De aceea, sunt selectați adesea aminoacizi stabili.
Alegerea depinde de secvența peptidică și de metoda de analiză.
Ce aminoacizi se pot modifica în timpul hidrolizei?
Hidroliza acidă poate avea efecte diferite.
Triptofan
Triptofanul poate fi în mare parte degradat în timpul hidrolizei acide standard.
De aceea, sunt necesare metode adaptate atunci când triptofanul trebuie măsurat în mod specific.
Asparagină
Asparagina poate fi transformată în aspartat în timpul hidrolizei.
Prin urmare, în analiza clasică, asparagina și aspartatul nu sunt întotdeauna raportate separat.
Glutamină
Glutamina poate fi transformată în glutamat.
Astfel, glutamina și glutamatul pot fi afișate împreună.
Serine
Serina se poate pierde parțial în timpul hidrolizei prelungite.
Treonină
Și treonina se poate degrada parțial.
Cisteină
Cisteina poate suferi modificări oxidative.
Pentru o analiză fiabilă, poate fi necesară o oxidare prealabilă sau o metodă adaptată.
De ce este important timpul de hidroliză?
Legăturile peptidice trebuie descompuse suficient.
O hidroliză prea scurtă poate duce la:
- degradare incompletă;
- valori măsurate ale aminoacizilor prea mici.
O hidroliză prea lungă poate duce la:
- degradarea ulterioară a aminoacizilor sensibili;
- pierderea prin măsurare.
De aceea, timpul și temperatura hidrolizei sunt controlate.
Uneori se folosesc mai mulți timpi de hidroliză pentru a investiga pierderea sau degradarea incompletă.
Ce este un raport molar?
Un raport molar descrie numărul relativ de aminoacizi.
Să presupunem că o peptidă conține teoretic:
- două alanine;
- o glicină;
- trei leucine.
Raportul molar teoretic este:
2 : 1 : 3
După analiză, valorile măsurate pot fi normalizate.
Când raportul este apropiat de valoarea teoretică, acest lucru susține compoziția de aminoacizi așteptată.
Abaterile mici pot apărea din cauza:
- incertitudinea de măsurare;
- pierderea prin hidroliză;
- derivatizarea;
- integrarea picurilor cromatografice.
Ce înseamnă normalizarea?
Prin normalizare, valorile măsurate ale aminoacizilor sunt convertite în proporții relative.
Un aminoacid adecvat poate fi utilizat ca referință.
Astfel, profilul măsurat poate fi comparat cu compoziția teoretică.
Normalizarea este utilă pentru analiza compoziției, dar nu oferă automat cantitatea absolută de peptide.
Analiza aminoacizilor versus puritatea HPLC
Puritatea HPLC și analiza aminoacizilor măsoară proprietăți diferite.
Puritatea HPLC examinează de obicei:
- picul cromatografic principal;
- cantitatea relativă a picurilor secundare.
Analiza aminoacizilor examinează:
- compoziția de aminoacizi;
- cantitatea aminoacizilor selectați;
- posibila cuantificare a peptidelor.
O puritate HPLC ridicată nu dovedește automat că compoziția de aminoacizi este corectă.
O compoziție adecvată de aminoacizi nu dovedește automat absența impurităților asociate peptidelor.
Tehnicile se completează reciproc.
Analiza aminoacizilor versus spectrometria de masă
Spectrometria de masă examinează raportul masă-sarcină al moleculelor.
O măsurare a masei intacte poate susține faptul că masa moleculară corespunde valorii teoretice.
Analiza aminoacizilor examinează cantitatea și proporția aminoacizilor după hidroliză.
Ambele tehnici au puncte forte diferite.
O combinație poate oferi mai multe informații despre:
- identitate;
- compoziția;
- conținutul de peptide.
Analiza aminoacizilor versus testul pentru peptide
Analiza aminoacizilor poate fi utilizată în sine ca metodă de determinare.
Un test pentru peptide descrie obiectivul:
determinarea cantității de peptide.
Analiza aminoacizilor este una dintre tehnicile prin care acest obiectiv poate fi atins.
Alte metode posibile de determinare sunt:
- HPLC cantitativă;
- spectrofotometria UV;
- cuantificarea LC-MS;
- bilanțul masic.
Ce influență au contraionii?
Contraioni precum:
- acetat;
- clorură;
- TFA;
contribuie la masa totală a materialului liofilizat.
În analiza aminoacizilor sunt examinate în principal componentele aminoacizilor din peptidă.
Astfel, metoda poate ajuta la diferențierea între:
- masa totală a materialului;
- cantitatea reală de peptide.
Pentru un bilanț masic complet pot fi necesare analize suplimentare.
Ce influență are umiditatea reziduală?
Umiditatea reziduală contribuie la greutatea totală, dar nu și la compoziția aminoacizilor.
La calcularea conținutului net de peptide, analiza umidității poate oferi informații suplimentare.
Un bilanț masic detaliat poate include:
- conținutul de peptide;
- conținutul de apă;
- conținutul de contraioni;
- alte componente.
Poate analiza aminoacizilor să evidențieze contaminanți?
Unele semnale neobișnuite ale aminoacizilor pot indica prezența unor componente neașteptate.
Cu toate acestea, metoda nu este concepută pentru a detecta orice posibil contaminant.
Pentru acestea pot fi necesare alte tehnici:
- impurități organice;
- solvenți reziduali;
- metale;
- contaminarea microbiologică;
- endotoxine.
Ce poate conține un COA?
Un certificat de analiză poate conține informații precum:
- test: analiza aminoacizilor;
- metoda de analiză;
- raporturile măsurate ale aminoacizilor;
- raporturile teoretice;
- conținutul calculat de peptide;
- data testării;
- numărul lotului.
Nu orice COA conține analiza aminoacizilor.
Atunci când au fost efectuate doar HPLC și MS, nu se poate deduce o cuantificare completă a aminoacizilor.
De ce este importantă asocierea cu lotul?
O analiză a aminoacizilor trebuie asociată lotului examinat.
Date importante sunt:
- numărul lotului;
- denumirea produsului;
- data analizei;
- laboratorul;
- metoda de analiză.
Un raport de analiză fără o asociere clară cu lotul are o valoare mai mică pentru trasabilitate.
Ce înseamnă incertitudinea de măsurare?
Orice analiză cantitativă implică o incertitudine de măsurare.
În analiza aminoacizilor, sursele de variație pot fi:
- pregătirea probei;
- hidroliza;
- pierderea aminoacizilor;
- derivatizarea;
- calibrarea;
- separarea cromatografică;
- integrarea vârfurilor.
Prin urmare, rezultatele nu trebuie considerate absolut lipsite de erori.
De ce este importantă validarea metodei?
O metodă trebuie să fie adecvată scopului propus.
În analiza cantitativă a aminoacizilor, caracteristicile relevante de validare pot include:
- acuratețea;
- precizia;
- liniaritatea;
- specificitatea;
- intervalul de măsurare;
- robustețea;
- repetabilitatea.
O metodă adecvată pentru un profil calitativ al aminoacizilor nu este automat suficientă pentru cuantificarea exactă a peptidelor.
Limitări științifice
Analiza aminoacizilor are limitări importante.
Metoda nu determină în mod independent:
- secvența exactă a aminoacizilor;
- masa moleculară;
- puritatea HPLC;
- structura tridimensională;
- activitatea biologică;
- sterilitatea;
- conținutul de endotoxine.
În plus, unii aminoacizi se pot modifica în timpul hidrolizei.
Pentru o evaluare amplă a calității, trebuie combinate mai multe tehnici analitice.
Rezumat
Analiza aminoacizilor examinează compoziția și cantitatea aminoacizilor dintr-o peptidă.
În analiza clasică, lanțul peptidic este mai întâi descompus prin hidroliză.
Ulterior, aminoacizii sunt:
- separați;
- detectați;
- cuantificați;
- comparată cu compoziția teoretică.
Analiza aminoacizilor poate fi utilizată pentru:
- verificarea compoziției aminoacizilor;
- evaluarea raporturilor molare;
- cuantificarea conținutului de peptide;
- susținerea identității.
Metoda are limitări, deoarece anumiți aminoacizi se pot modifica în timpul hidrolizei.
De aceea, analiza aminoacizilor este de preferat să fie combinată cu:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- testarea peptidelor;
- analiza umidității reziduale;
- analiza contraionilor.
Declinarea responsabilității privind cercetarea
Peptidele de cercetare Peptidera sunt oferite exclusiv pentru Research Use Only (RUO) și sunt destinate cercetării de laborator și aplicațiilor analitice.
Nu este destinat consumului uman sau animal, utilizării diagnostice, aplicațiilor terapeutice sau autoadministrării.
Cunoștințe despre peptide și controlul calității
Produse Peptidera conexe:
Peptide de cercetare liofilizate cu identificarea lotului și date analitice de calitate disponibile
Bloguri interne conexe:
- PB-0230 — Puritatea peptidelor și HPLC
- PB-0231 — Spectrometria de masă a peptidelor
- PB-0233 — Testarea peptidelor: puritate versus conținut de peptide
- PB-0234 — Umiditatea reziduală în peptidele liofilizate
- PB-0238 — Contraionii în peptide
Sugestii de linkuri interne:
- Link către PB-0233 privind analiza aminoacizilor ca test pentru peptide
- Link către PB-0230 privind diferența față de puritatea HPLC
- Link către PB-0231 privind masa moleculară și analiza secvenței
- Link către PB-0234 privind umiditatea reziduală și conținutul net de peptide
- Link către PB-0238 privind contraionii și bilanțul de masă
- Link către pagina Peptidera cu certificate de analiză
- Link către colecția de peptide pentru cercetare