Spectrometria de masă aplicată pe peptide explicată

Spectrometria de masă în cazul peptidelor: cum este investigată identitatea moleculară?

În controlul calității peptidelor destinate cercetării, sunt combinate adesea mai multe tehnici analitice. HPLC poate oferi informații despre puritatea cromatografică, însă un vârf principal înalt nu dovedește automat că este prezentă peptida corectă.

Pentru a investiga mai aprofundat identitatea moleculară, se utilizează adesea spectrometria de masă.

Spectrometria de masă, abreviată de obicei ca MS, este o tehnică analitică prin care se măsoară raportul masă-sarcină al moleculelor ionizate. În analiza peptidelor, masa moleculară măsurată poate fi comparată cu masa teoretică estimată pe baza secvenței de aminoacizi.

Atunci când aceste valori corespund, acest lucru susține identificarea peptidei analizate. Totuși, nici spectrometria de masă nu oferă singură o imagine completă a calității.

În acest articol discutăm despre modul în care funcționează spectrometria de masă, de ce peptidele pot produce mai multe semnale de masă și cum sunt interpretate rezultatele MS împreună cu HPLC și alte metode de analiză.

---

Ce este spectrometria de masă?

Spectrometria de masă este o tehnică analitică prin care moleculele sunt transformate în particule încărcate, numite ioni.

Acești ioni sunt apoi separați și măsurați pe baza raportului masă-sarcină.

Acest raport este reprezentat astfel:

m/z

Aici:

• m pentru masă;
• z pentru sarcina electrică.

Prin urmare, un spectrometru de masă nu măsoară întotdeauna direct masa moleculară completă. Instrumentul măsoară raportul dintre masă și sarcină.

În cazul moleculelor mai mari, inclusiv al multor peptide, se pot forma sarcini multiple. Prin urmare, aceeași peptidă poate fi vizibilă în diferite poziții ale spectrului de masă.

---

De ce se utilizează spectrometria de masă în analiza peptidelor?

O peptidă este alcătuită dintr-o secvență specifică de aminoacizi.

Fiecare combinație de aminoacizi are o masă moleculară ce poate fi calculată teoretic.

Spectrometria de masă poate fi utilizată pentru a verifica dacă masa măsurată corespunde acestei valori teoretice.

Analiza MS poate contribui la:

• confirmarea identității moleculare;
• compararea cu masa moleculară teoretică;
• detectarea anumitor modificări chimice;
• analiza produșilor de degradare;
• investigarea variantelor de peptide;
• compararea loturilor de producție.

O masă corespunzătoare susține identitatea unei peptide.

Totuși, rezultatul trebuie evaluat întotdeauna împreună cu metoda de analiză și cu alte date privind calitatea.

---

Care este masa moleculară teoretică?

Masa moleculară teoretică se calculează pe baza:

• secvența de aminoacizi;
• numărul de aminoacizi;
• eventuale modificări chimice;
• forma moleculară;
• grupări terminale specifice.

Când aminoacizii formează împreună un lanț peptidic, se formează legături peptidice.

În timpul formării fiecărei legături peptidice, o moleculă de apă este eliminată. Prin urmare, masa unei peptide complete nu este pur și simplu suma maselor tuturor aminoacizilor individuali.

Și modificările pot influența masa.

Exemple:

• amidarea;
• acetilarea;
• fosforilarea;
• oxidarea;
• adăugarea lanțurilor de acizi grași;
• formarea punților disulfidice.

Prin urmare, masa teoretică trebuie calculată pentru structura moleculară exactă.

---

Ce înseamnă greutate moleculară?

Termenii masă moleculară și greutate moleculară sunt adesea utilizați interschimbabil.

În rapoartele de laborator, valoarea este de obicei exprimată în:

• dalton, prescurtat Da;
• kilodalton, prescurtat kDa.

Un dalton corespunde aproximativ masei unui atom de hidrogen.

Prin urmare, o peptidă cu o masă moleculară de 3.000 Da are o masă de aproximativ 3 kDa.

Masa moleculară a peptidelor poate varia considerabil, în funcție de:

• lungimea lanțului;
• compoziția aminoacizilor;
• modificări chimice.

---

Cum funcționează un spectrometru de masă?

Un spectrometru de masă constă de obicei din mai multe componente.

1. Introducerea probei

Peptida este mai întâi pregătită și introdusă în instrument.

Pregătirea probei poate influența:

• intensitatea semnalului;
• detectabilitatea;
• formarea ionilor;
• semnale de fond.

2. Ionizarea

Moleculele sunt încărcate electric.

Tehnicile utilizate frecvent pentru analiza peptidelor sunt:

• ionizarea prin electrospray;
• desorbția/ionizarea cu laser asistată de matrice.

3. Analiza masei

Ionii formați sunt separați pe baza raportului masă-sarcină.

4. Detectarea

Detectorul înregistrează ionii.

5. Prelucrarea datelor

De gemeten signalen worden omgezet in een massaspectrum.

Dit spectrum bevat pieken die overeenkomen met gedetecteerde ionen.

---

Wat is electrospray ionization?

Electrospray ionization, afgekort tot ESI, is een veelgebruikte ionisatietechniek voor peptiden.

Tijdens ESI wordt een vloeibaar monster door een fijne opening geleid terwijl een elektrische spanning wordt aangebracht.

Hierdoor ontstaan elektrisch geladen druppeltjes.

Wanneer het oplosmiddel verdampt, blijven geladen moleculen over.

Een belangrijk kenmerk van ESI is dat grotere moleculen meerdere elektrische ladingen kunnen krijgen.

Een peptide kan bijvoorbeeld voorkomen als:

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

Hierbij staat M voor de moleculaire massa van de peptide.

Door meerdere ladingen ontstaan verschillende m/z-signalen voor dezelfde molecule.

---

Waarom heeft één peptide meerdere pieken?

Wanneer een peptide meerdere protonen opneemt, ontstaan verschillende ladingsvormen.

Stel dat een peptide een moleculaire massa heeft van ongeveer 3.000 Da.

Mogelijke signalen zijn dan ongeveer:

• o sarcină pozitivă: m/z în jur de 3.001;
• două sarcini pozitive: m/z în jur de 1.501;
• trei sarcini pozitive: m/z în jur de 1.001.

Toate aceste semnale pot aparține aceleiași peptide.

Software-ul poate utiliza această distribuție a sarcinilor pentru a calcula masa moleculară inițială.

Acest proces se numește deconvoluție.

---

Ce este un spectru de masă deconvoluat?

O măsurare ESI brută poate conține mai multe vârfuri de sarcină.

Acest lucru poate face interpretarea complexă.

Cu ajutorul software-ului de deconvoluție, diferitele forme de sarcină sunt convertite într-o singură masă moleculară estimată.

Spectrul deconvoluat poate fi astfel comparat mai ușor cu:

• masa teoretică;
• un standard de referință;
• specificațiile produsului.

Calitatea calculului depinde de:

• intensitatea semnalului;
• rezoluție;
• zgomot de fond;
• setările software;
• prezența componentelor suprapuse.

---

Ce este MALDI?

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, prescurtat MALDI, este o altă tehnică de ionizare.

Peptida este amestecată cu un material de matrice și aplicată pe o placă de măsurare.

Un laser activează matricea, generând ioni peptidici.

MALDI produce adesea în principal ioni cu sarcină unică.

Astfel, spectrul poate părea mai simplu decât un spectru ESI.

MALDI este combinată frecvent cu un analizor de masă time-of-flight.

Această combinație este denumită:

MALDI-TOF

---

Ce este time-of-flight?

Într-un analizor de masă time-of-flight, ionii sunt accelerați de un câmp electric.

Apoi, aceștia se deplasează printr-un tub de măsurare.

Ionii cu un raport masă-sarcină mai mic ajung de obicei mai repede la detector decât ionii cu un raport mai mare.

Timpul de zbor este utilizat pentru calcularea valorii m/z.

Sistemele TOF pot fi utilizate pentru:

• identificarea peptidelor;
• determinarea masei;
• compararea variantelor moleculare.

Acuratețea finală depinde de calibrare, setările instrumentului și pregătirea probei.

---

Ce este LC-MS?

Cromatografia lichidă cu spectrometrie de masă, prescurtată LC-MS, combină cromatografia lichidă cu spectrometria de masă.

Componentele sunt mai întâi separate cromatografic.

Apoi, semnalele individuale sunt analizate de spectrometrul de masă.

LC-MS poate combina informații despre:

• timp de retenție;
• profil cromatografic;
• masa moleculară;
• posibile impurități;
• produși de degradare.

Astfel, LC-MS poate oferi mai multe informații decât o analiză HPLC sau MS efectuată separat.

---

Care este diferența dintre HPLC și spectrometria de masă?

HPLC și spectrometria de masă răspund la întrebări analitice diferite.

HPLC

HPLC poate oferi informații despre:

• puritate cromatografică;
• cantitatea relativă a componentelor detectate;
• timpi de retenție;
• modificări ale profilului cromatografic.

Spectrometrie de masă

Spectrometria de masă poate oferi informații despre:

• masa moleculară;
• identitatea posibilă;
• modificări chimice;
• anumite produse de degradare.

O comparație simplificată:

De aceea, cele două tehnici sunt adesea combinate.

---

Poate apărea aceeași masă moleculară la peptide diferite?

Da.

Secvențe diferite de aminoacizi pot avea aceeași masă totală sau o masă totală aproape identică.

Acestea sunt numite uneori structuri izobare.

Prin urmare, o masă corespunzătoare nu dovedește întotdeauna că întreaga secvență de aminoacizi este corectă.

Pentru o identificare mai detaliată, pot fi necesare tehnici suplimentare, precum:

• spectrometria de masă în tandem;
• analiza fragmentării;
• analiza aminoacizilor;
• analiza secvenței;
• compararea cu un standard de referință.

Metoda de analiză necesară depinde de gradul de certitudine dorit.

---

Ce este spectrometria de masă în tandem?

Spectrometria de masă în tandem este scrisă de obicei astfel:

MS/MS

În timpul MS/MS, un ion peptidic selectat este fragmentat suplimentar.

Fragmentele formate sunt apoi măsurate din nou.

Modelul de fragmentare poate oferi informații despre:

• secvența aminoacizilor;
• localizarea modificărilor;
• identitatea peptidei;
• structura produselor de degradare.

Prin urmare, MS/MS poate oferi mai multe informații structurale decât masa moleculară intactă.

---

Ce sunt fragmentele peptidice?

Când un lanț peptidic se rupe în anumite locuri în timpul MS/MS, se formează ioni-fragment.

Tipurile de fragmente utilizate frecvent sunt:

• ioni b;
• ioni y.

Masele acestor fragmente pot fi utilizate pentru a reconstitui porțiuni ale secvenței de aminoacizi.

Interpretarea poate fi complexă.

Nu toate peptidele se fragmentează în același mod.

Factorii care pot avea influență includ:

• compoziția aminoacizilor;
• sarcina electrică;
• dimensiunea peptidei;
• metoda de fragmentare;
• modificări chimice.

---

Poate spectrometria de masă detecta oxidarea?

Anumite modificări oxidative provoacă o schimbare măsurabilă a masei.

De exemplu, adăugarea unui singur atom de oxigen duce adesea la o creștere a masei de aproximativ 16 Da.

Astfel, spectrometria de masă poate ajuta la identificarea anumitor produse de oxidare.

Detectarea depinde de:

• concentrația;
• rezoluția instrumentului;
• metoda de analiză;
• separarea componentelor.

Nu orice modificare oxidativă poate fi localizată complet exclusiv pe baza unui singur semnal de masă.

Pentru aceasta poate fi necesară o analiză suplimentară a fragmentării.

---

Poate spectrometria de masă determina cantitatea de peptide?

Nu automat.

Intensitatea unui semnal de masă este influențată de:

• eficiența ionizării;
• proprietățile moleculare;
• solventul;
• setările instrumentului;
• prezența altor componente.

Prin urmare, un semnal de două ori mai intens nu înseamnă automat că este prezentă o cantitate de peptidă de două ori mai mare.

Pentru o cuantificare fiabilă sunt necesare metode validate și standarde adecvate.

Tehnicile posibile sunt:

• LC-MS cantitativă;
• standarde interne;
• referințe marcate izotopic;
• teste HPLC calibrate.

---

Poate spectrometria de masă demonstra sterilitatea?

Nu.

Spectrometria de masă pentru identificarea peptidelor nu este un test de sterilitate.

Rezultatul nu oferă informații directe despre:

• bacterii;
• fungi;
• creșterea microorganismelor;
• sterilitatea produsului.

Sterilitatea necesită metode specifice de testare microbiologică.

Nici endotoxinele nu sunt determinate automat în timpul unei analize standard MS a peptidelor.

---

Poate spectrometria de masă măsura endotoxinele?

Nu printr-o analiză standard de identificare.

Endotoxinele sunt componente bacteriene complexe.

Pentru analiza endotoxinelor se folosesc metode specifice, precum:

• testul de liză a amebocitelor de Limulus;
• metode bazate pe factorul C recombinant.

Prin urmare, un spectru de masă corect al unei peptide nu dovedește că materialul are un nivel scăzut de endotoxine.

Identitatea, puritatea, sterilitatea și endotoxinele sunt parametri de calitate distincti.

---

De ce pot diferi rezultatele de laborator?

Laboratoare diferite pot raporta valori ale masei ușor diferite.

Cauzele posibile sunt:

• tipul instrumentului;
• calibrarea;
• metoda de ionizare;
• pregătirea probei;
• aducți de sare;
• software-ul utilizat;
• rezoluție;
• metoda de interpretare.

Diferențele mici nu înseamnă automat că un rezultat este incorect.

Valoarea măsurată trebuie evaluată în limitele:

• acuratețea instrumentului;
• forma moleculară așteptată;
• metoda de analiză utilizată.

---

Ce sunt aductele?

În timpul spectrometriei de masă, ionii peptidici se pot lega de alte particule încărcate.

Exemple:

• sodiu;
• potasiu;
• amoniu.

Astfel pot apărea vârfuri suplimentare.

De exemplu, un aduct de sodiu are o masă diferită de cea a unui ion peptidic simplu protonat.

Aductele nu înseamnă automat că este prezentă o altă peptidă.

Interpretarea necesită cunoștințe despre:

• pregătirea probei;
• soluțiile tampon utilizate;
• formele ionice așteptate.

---

Ce informații trebuie să conțină un raport MS?

Un raport de analiză profesional poate conține, printre altele:

• numele peptidei;
• numărul lotului sau al seriei;
• masa moleculară teoretică;
• masa moleculară măsurată;
• metoda de ionizare;
• tipul spectrometrului de masă;
• spectrul de masă;
• data analizei;
• numele laboratorului.

În cadrul unei analize mai ample pot fi menționate și:

• interval de măsurare;
• rezoluție;
• acuratețea masei;
• date de fragmentare;
• software utilizată.

Raportarea necesară depinde de obiectivul cercetării.

---

Spectrometria de masă și controlul loturilor

Fiecare lot de producție poate fi analizat separat.

Analiza MS specifică lotului sprijină:

• controlul identității;
• compararea loturilor;
• trasabilitate;
• investigarea abaterilor.

Numărul lotului de pe raportul de analiză trebuie să corespundă identificării de pe flacon.

Un rezultat de spectrometrie de masă fără o asociere clară cu lotul are o valoare mai limitată pentru trasabilitate.

---

Limitări științifice

Spectrometria de masă este o tehnică analitică puternică, dar nu reprezintă o evaluare completă a calității.

O masă moleculară corespunzătoare nu dovedește automat:

• secvență completă de aminoacizi;
• puritate cromatografică ridicată;
• cantitatea corectă de peptidă;
• sterilitate;
• conținut scăzut de endotoxine;
• activitate biologică;
• stabilitate pe termen lung.

Pentru o evaluare mai amplă, pot fi necesare mai multe metode:

• HPLC;
• LC-MS;
• MS/MS;
• test cantitativ;
• studiu de stabilitate;
• analiza umidității;
• teste suplimentare specifice produsului.

Rezultatele trebuie interpretate împreună.

---

Rezumat

Spectrometria de masă este utilizată pentru investigarea masei moleculare a peptidelor pentru cercetare.

Tehnica măsoară raportul masă-sarcină al moleculelor ionizate.

În analiza peptidelor, masa măsurată poate fi comparată cu masa teoretică așteptată.

O concordanță susține identificarea moleculară.

Tehnicile analitice importante includ:

• ESI-MS;
• MALDI-TOF;
• LC-MS;
• MS/MS.

Totuși, spectrometria de masă nu oferă automat informații despre:

• cantitate exactă;
• puritate cromatografică;
• sterilitate;
• endotoxine;
• activitate biologică.

De aceea, MS este adesea combinată cu HPLC și cu analize suplimentare de calitate.

---

Declinarea responsabilității privind cercetarea

Peptidele pentru cercetare de la Peptidera sunt oferite exclusiv pentru Research Use Only (RUO) și sunt destinate cercetării de laborator și aplicațiilor analitice.

Nu este destinat consumului uman sau animal, utilizării diagnostice, aplicării terapeutice sau autoadministrării.

---

Categorie:
Cunoștințe despre peptide și controlul calității

Produse Peptidera asociate:
Peptide pentru cercetare liofilizate, cu identificarea lotului și date analitice de calitate disponibile

Bloguri interne asociate:

• PB-0227 — Peptide liofilizate și liofilizarea
• PB-0228 — Flacoanele cu peptide și integritatea ambalajului
• PB-0229 — Numerele loturilor și trasabilitatea
• PB-0230 — Puritatea peptidelor și HPLC
• Ce este un Certificat de analiză?

Propuneri de linkuri interne:

• Link către PB-0230 privind diferența dintre HPLC și MS
• Link către PB-0229 privind analiza specifică lotului
• Link către pagina COA privind rezultatele testelor prin spectrometrie de masă
• Link către colecția de peptide pentru cercetare
• Link către pagina despre analiza independentă de laborator