Standardele de referință pentru peptide explicate
Standarde de referință pentru peptide: de ce este importantă comparația analitică
În analiza calității peptidelor destinate cercetării sunt utilizate frecvent tehnici precum:
- HPLC;
- LC-MS;
- dozarea peptidului;
- analiza aminoacizilor;
- spectrofotometrie UV.
Aceste instrumente generează date de măsurare, însă un semnal al detectorului sau un pic cromatografic nu are automat o semnificație exactă.
Pentru a identifica sau cuantifica în mod fiabil o probă necunoscută, aceasta poate fi comparată cu un material ale cărui proprietăți relevante au fost deja stabilite cu atenție.
Un astfel de material este numit standard de referință.
Un standard de referință pentru peptide bine caracterizat poate fi utilizat pentru:
- identificarea;
- compararea timpilor de retenție;
- cuantificarea;
- calibrarea;
- evaluarea metodelor HPLC;
- investigarea impurităților;
- analiza produselor de degradare;
- sprijinirea trasabilității măsurătorilor.
Calitatea unui rezultat analitic nu depinde, prin urmare, numai de instrumentul de laborator. Identitatea, puritatea, conținutul de peptid, condițiile de depozitare și documentația standardului de referință utilizat sunt, de asemenea, importante.
Un standard de referință nu este automat același lucru cu o probă oarecare cu un procent HPLC ridicat. Pentru utilizarea cantitativă, trebuie să fie clar cât peptid propriu-zis este prezent și ce componente care nu sunt peptide contribuie la masa totală.
În acest articol discutăm ce sunt standardele de referință pentru peptide, prin ce diferă standardele primare de cele secundare și de ce este importantă comparația analitică pentru o analiză fiabilă a peptidelor.
Ce este un standard de referință pentru peptide?
Un standard de referință pentru peptide este un material caracterizat cu atenție, utilizat ca bază de comparație în timpul analizei de laborator.
În funcție de obiectivul cercetării, pot fi stabilite proprietăți precum:
- secvența de aminoacizi;
- masa moleculară;
- identitatea;
- puritate HPLC;
- conținutul de peptide;
- conținutul de apă;
- conținutul de contraioni;
- prezența impurităților relevante;
- stabilitatea la depozitare.
Standardul poate fi apoi utilizat pentru a compara analitic o probă necunoscută.
Caracterizarea necesară depinde de aplicație.
Un standard pentru identificare nu trebuie să îndeplinească întotdeauna exact aceleași cerințe ca un standard pentru testarea cantitativă.
De ce este necesară comparația analitică?
Un instrument de laborator măsoară un semnal fizic sau chimic.
Exemplele includ:
- absorbție UV;
- fluorescență;
- suprafața picului cromatografic;
- raportul masă-sarcină;
- intensitatea ionilor.
Un semnal nu este automat egal cu o cantitate exactă de peptid.
Pentru aceasta este necesară o relație fiabilă între:
- cantitate cunoscută;
- semnal măsurat;
- probă necunoscută.
Un standard de referință poate ajuta la stabilirea acestei relații.
Un exemplu simplu
Să presupunem că un laborator dorește să determine cantitatea unui peptid prin HPLC cantitativă.
Laboratorul prepară diferite soluții ale unui standard de referință caracterizat:
- 0,1 mg/ml;
- 0,25 mg/ml;
- 0,5 mg/ml;
- 0,75 mg/ml;
- 1,0 mg/ml.
Fiecare soluție este analizată.
Ariile vârfurilor măsurate sunt reprezentate în funcție de concentrațiile cunoscute.
Astfel se obține o curbă de calibrare.
Apoi se măsoară proba necunoscută.
Concentrația poate fi calculată prin compararea semnalului probei cu curba de calibrare.
Fiabilitatea acestui calcul depinde, printre altele, de:
- calitatea standardului de referință;
- calcularea corectă a concentrației;
- cântărire precisă;
- pipetare precisă;
- liniaritatea metodei;
- stabilitatea soluțiilor.
Ce este un standard de referință primar?
Un standard de referință primar este un material ale cărui proprietăți relevante au fost stabilite în detaliu.
Standardul poate fi caracterizat prin mai multe tehnici analitice independente.
Analizele posibile includ:
- HPLC;
- LC-MS;
- analiza aminoacizilor;
- determinarea conținutului de apă;
- analiza contraionilor;
- RMN;
- analiză elementală;
- bilanț de masă.
Scopul este de a stabili cu un grad ridicat de fiabilitate:
- ce material este prezent;
- cât de pur este;
- cât de multă componentă dorită este prezentă;
- ce factori de corecție sunt necesari.
Un standard primar poate fi apoi utilizat pentru calificarea altor standarde.
Ce este un standard de referință secundar?
Un standard de referință secundar mai este numit:
- standard de lucru;
- standard de lucru;
- standard de referință intern;
Acest standard este calificat prin comparație cu un standard primar sau cu un standard de referință recunoscut oficial.
Un standard secundar poate fi utilizat pentru analizele de rutină de laborator.
Avantajele posibile sunt:
- disponibilitate mai mare;
- costuri mai mici;
- conservarea standardului primar;
- utilizare de rutină mai eficientă.
Totuși, standardul secundar trebuie verificat periodic și depozitat corespunzător.
De ce nu este utilizat întotdeauna standardul primar?
Standardele primare pot:
- sunt disponibile în cantități limitate;
- sunt costisitoare;
- sunt furnizate în cantități mici;
- destinate unor metode oficiale specifice de analiză.
Prin calificarea unui standard secundar față de un standard primar, se pot efectua analize de rutină fără utilizarea constantă a standardului primar.
Fiabilitatea depinde de calitatea calificării.
Ce înseamnă calificarea unui standard de lucru?
Calificarea înseamnă că proprietățile standardului de lucru sunt examinate sistematic și comparate cu o referință adecvată.
Un program de calificare poate consta în:
- controlul identității;
- puritate HPLC;
- dozarea peptidului;
- conținutul de apă;
- conținutul de contraioni;
- compararea cromatogramelor;
- compararea spectrelor de masă;
- evaluarea stabilității.
Testele necesare depind de utilizarea preconizată.
Identitate versus cuantificare
Un standard de referință poate avea diferite funcții analitice.
Standard de identitate
Un standard de identitate este utilizat pentru a verifica dacă o probă necunoscută corespunde peptidei așteptate.
Comparațiile posibile sunt:
- Timp de retenție HPLC;
- masa moleculară;
- profil spectrometric de masă;
- proprietăți spectroscopice.
Standard cantitativ
Un standard cantitativ este utilizat pentru determinarea cantității de peptidă.
Pentru aceasta, conținutul efectiv de peptidă trebuie cunoscut cu suficientă certitudine.
O puritate HPLC ridicată, considerată singură, nu este de obicei suficientă în acest scop.
De ce nu este suficientă puritatea HPLC?
O peptidă poate avea, de exemplu, o puritate HPLC de 99%.
Aceasta nu înseamnă automat că 99% din masa totală este constituită din peptidă.
Materialul poate conține, de asemenea:
- apă;
- acetat;
- clorură;
- TFA;
- săruri;
- alte componente măsurate necromatografic.
Prin urmare, pentru un standard cantitativ trebuie făcută distincția între:
- puritate cromatografică;
- masa totală a materialului;
- conținut net de peptidă.
Ce este valoarea atribuită?
Un standard de referință poate avea o valoare atribuită.
Această valoare descrie, de exemplu:
- conținutul de peptide;
- puritatea;
- concentrație;
- potență;
- cantitatea per ambalaj.
Valoarea atribuită trebuie să se bazeze pe date analitice adecvate.
De asemenea, poate fi indicat un factor de corecție.
Ce este un factor de corecție?
Un factor de corecție este utilizat pentru a converti cantitatea de material cântărită în cantitatea efectivă de peptidă.
Să presupunem:
- material cântărit: 10,0 mg;
- conținut de peptidă atribuit: 85%;
- cantitatea efectivă de peptidă: 8,5 mg.
Dacă această corecție nu este aplicată, concentrația calculată poate fi supraestimată.
De ce este important conținutul net de peptidă?
Conținutul net de peptidă descrie proporția de peptidă efectivă din materialul analizat.
La calcul pot fi luați în considerare factori precum:
- umiditate reziduală;
- contraioni;
- componente organice;
- componente anorganice.
Pentru analiza cantitativă, aceasta este adesea mai relevantă decât puritatea HPLC considerată singură.
Ce rol are analiza aminoacizilor?
Analiza aminoacizilor poate fi utilizată pentru determinarea conținutului de peptidă.
Lanțul peptidic este hidrolizat astfel până la aminoacizi individuali.
Aminoacizii selectați sunt apoi cuantificați.
Când se cunoaște cantitatea acestor aminoacizi prezentă în fiecare lanț peptidic, poate fi calculată cantitatea de peptidă.
Analiza aminoacizilor poate contribui astfel la atribuirea valorii unui standard de referință.
Ce rol are spectrometria de masă?
Spectrometria de masă poate contribui la confirmarea:
- masa moleculară;
- identitatea;
- anumite modificări;
- produși de degradare.
LC-MS poate combina separarea cromatografică cu detecția de masă.
O masă moleculară corespunzătoare susține identitatea, dar nu dovedește în mod independent:
- cantitatea exactă de peptidă;
- secvența completă;
- absența tuturor impurităților.
De aceea, sunt adesea combinate mai multe tehnici.
Ce rol are MS/MS?
În spectrometria de masă tandem, un ion peptidic selectat este fragmentat.
Fragmentele pot oferi informații despre secvența aminoacizilor.
MS/MS poate oferi astfel suport suplimentar pentru:
- confirmarea secvenței;
- localizarea modificărilor;
- identificarea produselor de degradare.
Puterea analitică depinde de:
- dimensiunea peptidei;
- fragmentarea;
- rezoluția instrumentului;
- procesarea datelor.
Ce rol are HPLC?
HPLC poate fi utilizată pentru:
- compararea timpilor de retenție;
- evaluarea purității cromatografice;
- investigarea vârfurilor secundare;
- testare cantitativă;
- studiu de stabilitate.
În timpul comparației, referința și proba trebuie analizate folosind aceeași metodă controlată.
Parametrii importanți sunt:
- tipul coloanei;
- fază mobilă;
- temperatura;
- debit;
- lungimea de undă de detecție.
Ce este o curbă de calibrare?
O curbă de calibrare descrie relația dintre concentrațiile cunoscute și semnalele măsurate ale detectorului.
O curbă de calibrare fiabilă trebuie evaluată în funcție de:
- liniaritatea;
- interval de măsurare;
- reproductibilitate;
- abateri;
- adecvarea pentru metoda analitică.
Concentrația necunoscută este calculată în intervalul de măsurare validat.
Extrapolarea în afara acestui interval poate cauza incertitudine suplimentară.
Ce este liniaritatea?
Liniaritatea descrie măsura în care semnalul măsurat se modifică proporțional cu concentrația.
Când concentrația se dublează, într-un interval liniar este de așteptat o modificare corespunzătoare a semnalului.
Relația nu trebuie să fie liniară pentru fiecare metodă pe întregul interval de concentrație.
Prin urmare, intervalul de măsurare relevant este investigat experimental.
Ce înseamnă trasabilitatea analitică?
Trasabilitatea analitică sau metrologică descrie modul în care un rezultat de măsurare este legat de o referință recunoscută printr-un lanț documentat de comparații.
Componentele importante sunt:
- standardul utilizat;
- certificat;
- valoarea atribuită;
- calibrarea;
- metoda analitică;
- incertitudine de măsurare;
- documentația.
Trasabilitatea susține comparabilitatea rezultatelor între:
- zile diferite de măsurare;
- laboratoare;
- instrumente;
- loturi.
Ce este trasabilitatea metrologică?
Metrologia este știința măsurării.
Trasabilitatea metrologică necesită un lanț documentat și neîntrerupt de comparații până la o referință specificată. Fiecare etapă contribuie la incertitudinea totală de măsurare.
Pentru analiza peptidelor, trasabilitatea practică poate depinde, printre altele, de:
- standardul de referință;
- conținutul de peptide atribuit;
- balanță calibrată;
- echipament volumetric;
- metodă analitică.
Ce este incertitudinea de măsurare?
Orice măsurare analitică implică incertitudine.
Sursele posibile sunt:
- incertitudinea standardului de referință;
- cântărire;
- pipetare;
- diluare;
- variația instrumentului;
- calibrarea;
- integrarea vârfurilor;
- pregătirea probei.
Incertitudinea de măsurare nu înseamnă că un rezultat nu este fiabil.
Acesta descrie intervalul estimat în care valoarea reală se poate situa în mod rezonabil.
De ce trebuie standardele să fie specifice lotului?
Și standardele de referință sunt produse în loturi.
Loturile diferite pot varia în:
- conținutul de peptide;
- conținutul de apă;
- conținutul de contraioni;
- profil de puritate;
- stabilitate.
Prin urmare, trebuie să fie clar ce număr de lot al standardului de referință a fost utilizat.
Ce apare pe un certificat al unui standard de referință?
Un certificat poate conține informații despre:
- denumirea;
- numărul de catalog;
- numărul lotului;
- valoarea atribuită;
- utilizarea propusă;
- condiții de depozitare;
- informații privind valabilitatea;
- metode analitice;
- factor de corecție.
Nu toate certificatele conțin aceleași date.
Standardul trebuie utilizat conform instrucțiunilor aferente.
De ce sunt importante condițiile de depozitare?
Un standard de referință se poate modifica în timpul depozitării.
Procesele posibile includ:
- oxidare;
- deamidare;
- absorbția umidității;
- agregare;
- degradare.
Prin urmare, se pot stabili condiții pentru:
- temperatura;
- protecția împotriva luminii;
- protecția împotriva umidității;
- utilizarea după deschidere;
- durata depozitării.
Un standard depozitat necorespunzător poate cauza comparații incorecte.
Ce este o dată de expirare?
Unele standarde de referință au o dată de expirare stabilită.
Alte standarde utilizează:
- verificarea valabilității;
- data recalificării;
- statutul actual al lotului.
Laboratorul trebuie să verifice dacă standardul este adecvat și valabil la momentul utilizării.
Ce este recalificarea?
Recalificarea constă în reevaluarea unui standard de referință.
Analizele posibile includ:
- HPLC;
- LC-MS;
- dozarea peptidului;
- conținutul de apă;
- compararea cu un standard primar.
Recalificarea poate fi necesară după:
- perioada de utilizare prestabilită;
- depozitarea pe termen lung;
- modificarea aspectului;
- rezultat analitic neconform.
De ce sunt importante standardele de impurități?
Nu numai peptida dorită poate fi utilizată ca standard.
Impuritățile sau produsele de degradare cunoscute pot servi, de asemenea, drept materiale de referință.
Exemplele includ:
- produselor de oxidare;
- variantelor deamidate;
- fragmentelor;
- secvențelor cu deleții;
- componentelor asociate agregării.
Aceste standarde pot ajuta la identificarea și cuantificarea picurilor secundare.
Ce sunt standardele de degradare?
Un standard de degradare reprezintă o variantă de degradare cunoscută.
Aceasta poate fi utilizată pentru investigarea:
- unde eluează un produs de degradare;
- ce masă moleculară este prezentă;
- cât de sensibilă este metoda analitică;
- cantitatea de produs de degradare prezentă.
Nu orice produs de degradare este disponibil sub forma unui standard pur.
Standardele de referință și validarea metodei
O metodă analitică trebuie să fie demonstrabil adecvată scopului propus.
ICH Q2(R2) descrie principiile pentru validarea procedurilor analitice. Caracteristicile relevante pot include, printre altele, specificitatea, exactitatea, precizia, liniaritatea și intervalul de măsurare.
Standardele de referință pot fi utilizate pentru investigarea:
- exactitatea;
- specificitatea;
- liniaritatea;
- intervalul cantitativ;
- performanța metodei.
Ce este exactitatea?
Exactitatea descrie cât de apropiat este un rezultat măsurat de o valoare de referință acceptată.
Un standard bine caracterizat poate fi utilizat pentru investigarea exactității unei metode analitice.
Ce este precizia?
Precizia descrie cât de apropiate sunt între ele rezultatele măsurătorilor repetate.
O metodă poate furniza rezultate foarte precise, care totuși se abat sistematic.
Prin urmare, atât precizia, cât și acuratețea sunt importante.
Ce este specificitatea?
Specificitatea descrie dacă metoda analitică poate diferenția suficient componenta dorită de celelalte componente.
Exemplele includ:
- impurităților;
- produselor de degradare;
- componentelor formulării;
- contraionilor.
Un standard de referință adecvat poate ajuta la identificarea vârfului principal.
Pot obține două laboratoare rezultate diferite?
Da.
Diferențele pot apărea din cauza:
- standardul de referință;
- metoda analitică;
- pregătirea probei;
- echipamentul;
- calibrarea;
- prelucrarea datelor;
- incertitudinea de măsurare.
Utilizarea standardelor bine caracterizate și a metodelor validate poate îmbunătăți comparabilitatea.
Este automat o peptidă comercială un standard de referință?
Nu.
O peptidă comercială poate fi potrivită ca material de cercetare, dar nu este automat un standard de referință calificat.
Pentru utilizarea ca standard, trebuie să fie clar:
- identitatea;
- conținutul de peptide;
- puritatea;
- conținutul de apă;
- conținutul de contraioni;
- stabilitatea la depozitare;
- documentația.
Cerințele depind de scopul analitic.
Standarde farmacopeice oficiale de referință
Organizațiile oficiale pun la dispoziție standarde de referință pentru aplicații compendiale specifice.
Exemplele includ:
- Standarde de referință USP;
- Standarde de referință ale Farmacopeii Europene;
- Substanțe chimice internaționale de referință ale OMS.
Aceste standarde sunt destinate aplicațiilor descrise în metodele oficiale sau în documentația aferentă.
Nu există un standard farmacopeic oficial pentru fiecare peptidă de cercetare.
Limitări științifice
Un standard de referință îmbunătățește comparabilitatea analitică, dar nu soluționează toate provocările de măsurare.
Fiabilitatea rămâne dependentă de:
- metoda analitică;
- pregătirea probei;
- instrumentul;
- calibrarea;
- stocarea;
- prelucrarea datelor;
- incertitudinea de măsurare.
Un timp de retenție HPLC corespunzător nu dovedește de unul singur identitatea moleculară completă.
O masă moleculară corespunzătoare nu dovedește automat:
- secvența completă corectă;
- cantitatea exactă de peptidă;
- absența tuturor impurităților.
Prin urmare, se utilizează mai multe tehnici analitice complementare.
Rezumat
Un standard de referință pentru peptide este un material bine caracterizat, utilizat ca bază de comparație analitică.
Standardele de referință pot fi utilizate pentru:
- identificarea;
- comparația HPLC;
- calibrarea;
- dozarea peptidului;
- cuantificarea;
- validarea metodei;
- analiza impurităților.
Un standard primar este caracterizat în detaliu.
Un standard secundar sau de lucru este calificat în raport cu o referință primară adecvată și poate fi utilizat pentru analiza de rutină.
Pentru aplicațiile cantitative, puritatea HPLC singură este de obicei insuficientă. Trebuie evaluate și conținutul de peptide, apa, contraionii și alte componente relevante.
Comparația analitică fiabilă necesită:
- standard de referință adecvat;
- atribuirea corectă a valorii;
- trasabilitatea lotului;
- depozitare controlată;
- metodă de analiză validată;
- evaluarea incertitudinii de măsurare.
Surse oficiale și referințe științifice
-
ICH Q2(R2) — Validarea procedurilor analitice
Orientare internațională pentru validarea procedurilor analitice, inclusiv specificitatea, exactitatea, precizia, liniaritatea și domeniul de măsurare. -
USP — Standarde oficiale de referință
USP descrie standardele de referință ca materiale caracterizate în detaliu pentru cercetarea identității, concentrației, purității și calității, printre altele. -
Standarde de referință ale Farmacopeei Europene — EDQM
Catalogul EDQM conține standarde de referință oficial valabile pentru aplicațiile descrise în Farmacopeea Europeană. -
OMS — Substanțe chimice internaționale de referință
WHO-ICRS sunt stabilite prin proceduri aliniate la orientările OMS pentru substanțele chimice de referință. -
NIST — Trasabilitate metrologică
NIST descrie trasabilitatea metrologică drept un lanț documentat și neîntrerupt de etalonări către referințe specificate. -
NIST — Materiale de referință standard
NIST dezvoltă și certifică materiale de referință cu o compoziție sau proprietăți bine caracterizate, pentru a sprijini măsurători fiabile și comparabile. -
FDA — Proceduri analitice și validarea metodelor pentru medicamente și produse biologice
Orientările FDA abordează utilizarea și calificarea standardelor de referință în cadrul validării metodelor analitice.
Declinare de responsabilitate privind cercetarea
Peptidele de cercetare de la Peptidera sunt oferite exclusiv pentru Research Use Only (RUO) și sunt destinate cercetării de laborator și aplicațiilor analitice.
Nu este destinat consumului uman sau animal, utilizării diagnostice, aplicării terapeutice sau autoadministrării.
Categorie:
Cunoștințe despre peptide și controlul calității
Produse Peptidera conexe:
Peptide de cercetare cu identificarea lotului și date analitice independente disponibile privind calitatea
Bloguri interne conexe:
- PB-0230 — Puritatea peptidelor și HPLC
- PB-0231 — Spectrometria de masă în cazul peptidelor
- PB-0233 — Testarea peptidelor: puritate versus conținutul de peptide
- PB-0238 — Contraionii în cazul peptidelor
- PB-0239 — Analiza aminoacizilor în cazul peptidelor
- PB-0241 — Lanțul de custodie în analiza peptidelor
Propuneri de linkuri interne:
- Link către PB-0230 privind timpul de retenție HPLC și comparația cromatografică
- Link către PB-0231 privind LC-MS, masa moleculară și MS/MS
- Link către PB-0233 privind testele cantitative pentru peptide
- Link către PB-0238 privind contraionii și conținutul net de peptide
- Link către PB-0239 privind analiza aminoacizilor și atribuirea valorii
- Link către PB-0241 privind trasabilitatea standardelor și probelor
- Link către pagina Peptidera cu certificate de analiză independente
- Link către colecția de peptide de cercetare