Puritatea peptidei: ce înseamnă 99% HPLC?
Puritatea peptidei explicată: ce indică de fapt un procent HPLC?
În cazul peptidelor destinate cercetării, este indicat adesea un procent de puritate. Valori precum 98%, 99% sau 99,5% puritate sunt folosite în mod regulat pentru a descrie calitatea unei peptide.
Un procent ridicat pare simplu de interpretat: cu cât numărul este mai mare, cu atât produsul este mai bun. În practică, puritatea peptidei este mai complexă.
Un rezultat HPLC oferă informații despre compoziția relativă a unei probe analizate. Totuși, procentul nu dovedește automat:
- că peptida corectă este prezentă;
- că secvența de aminoacizi este complet corectă;
- că cantitatea specificată de peptidă din flacon este corectă;
- că materialul este steril;
- că nu conține endotoxine;
- că au fost măsurate toate impuritățile posibile.
Pentru a evalua cu atenție calitatea peptidei, trebuie analizate împreună mai multe date analitice.
În acest articol de blog discutăm cum se măsoară puritatea peptidei, ce înseamnă un procent HPLC și de ce puritatea reprezintă doar un element al controlului complet al calității.
Ce înseamnă puritatea peptidei?
Puritatea peptidei descrie proporția componentelor detectate asociate peptidei care corespunde componentei principale din proba analizată.
Când un certificat de analiză indică, de exemplu, o puritate HPLC de 99% când este menționată, aceasta înseamnă de obicei că aproximativ 99% din semnalul cromatografic integrat a fost atribuit vârfului principal.
Acest lucru nu înseamnă automat că 99% din greutatea totală din flacon constă în peptida dorită.
Un flacon poate conține, pe lângă peptidă, și alte componente, precum:
- apă;
- contraioni;
- săruri;
- excipienți;
- reziduuri rezultate în urma producției;
- componente nedetectabile.
Prin urmare, procentul HPLC și cantitatea reală de peptide sunt parametri de calitate diferiți.
Ce este HPLC?
HPLC este abrevierea pentru High-Performance Liquid Chromatography.
Este o tehnică analitică prin care diferite componente chimice dintr-o probă pot fi separate unele de altele.
În timpul unei analize HPLC, o probă dizolvată este trecută printr-o coloană. Această coloană conține o fază staționară.
Lichidul care curge prin coloană se numește fază mobilă.
Moleculele diferite nu reacționează toate în același mod cu aceste faze. Prin urmare, unele componente se deplasează prin coloană mai repede decât altele.
Rezultatul este prezentat într-un cromatogramă.
Un cromatogramă constă de obicei din:
- o axă orizontală a timpului;
- o axă verticală a semnalului;
- unul sau mai multe vârfuri.
Fiecare vârf reprezintă o componentă detectată sau un grup de componente.
Ce este un timp de retenție?
Timpul necesar unei componente pentru a se deplasa prin coloana HPLC și a ajunge la detector se numește timp de retenție.
Timpul de retenție poate fi influențat de:
- tipul coloanei HPLC;
- compoziția fazei mobile;
- temperatura;
- debitul;
- proprietățile peptidei;
- metoda de analiză utilizată.
Un timp de retenție corespunzător poate ajuta la compararea cu un standard de referință.
Totuși, un timp de retenție, luat singur, este de obicei insuficient pentru a confirma definitiv identitatea unei peptide.
În anumite condiții, molecule diferite pot avea timpi de retenție similari.
De aceea, HPLC este adesea combinată cu spectrometria de masă.
Cum se calculează procentul de puritate?
În multe analize HPLC, aria de sub fiecare vârf cromatografic este calculată.
Acest lucru se numește integrarea ariei vârfului.
Un exemplu simplificat:
- vârful principal: 99%;
- vârful secundar A: 0,5%;
- vârful secundar B: 0,3%;
- alte vârfuri detectate: 0,2%.
Puritatea cromatografică raportată este atunci de aproximativ 99%.
Acest calcul depinde de:
- metoda de detecție;
- setările de integrare;
- lungimea de undă aleasă;
- metoda de analiză;
- limita de detecție;
- concentrația probei.
Prin urmare, procentul de puritate trebuie interpretat întotdeauna în contextul metodei utilizate.
Ce înseamnă un vârf principal?
Cel mai mare vârf dintr-o cromatogramă este adesea numit vârful principal.
În cazul unei peptide bine caracterizate, se așteaptă ca acest vârf să corespundă peptidei dorite.
Totuși, acest lucru trebuie confirmat analitic.
Un vârf mare nu dovedește în mod independent că este prezentă structura moleculară corectă.
Pentru susținerea identității, pot fi utilizate tehnici suplimentare, precum:
- spectrometrie de masă;
- analiza aminoacizilor;
- analiza secvenței;
- rezonanță magnetică nucleară;
- compararea cu un standard de referință.
HPLC descrie în principal compoziția cromatografică a probei.
Ce impurități pot apărea în timpul sintezei peptidice?
Multe peptide sintetice sunt produse prin sinteza peptidică în fază solidă, de obicei abreviată SPPS.
În timpul acestui proces, aminoacizii sunt cuplați treptat la un lanț peptidic aflat în creștere.
La fiecare etapă pot apărea mici abateri ale procesului.
Posibilele impurități asociate peptidelor sunt:
Lanțuri peptidice scurtate
Atunci când un aminoacid nu este cuplat corect, se poate forma un lanț peptidic incomplet.
Aceasta mai este numită și produs de trunchiere.
Secvențe de deleție
În cazul unei secvențe cu deleție, unul sau mai mulți aminoacizi lipsesc din lanțul intenționat.
Prin urmare, masa moleculară diferă de cea a peptidei dorite.
Variante modificate chimic
În timpul producției, purificării sau depozitării pot apărea modificări chimice.
Exemplele includ:
- oxidare;
- deamidare;
- hidroliză;
- izomerizare.
Reziduuri de grupări protectoare
În timpul sintezei peptidelor se utilizează grupări protectoare temporare pentru a preveni reacțiile nedorite.
Acestea trebuie îndepărtate ulterior.
Îndepărtarea incompletă poate contribui la apariția componentelor secundare.
Agregate
Moleculele de peptide pot forma structuri mai mari în anumite condiții.
Nu toate metodele HPLC detectează sau caracterizează agregarea în același mod.
Puritatea HPLC de 99% este același lucru cu un conținut de peptide de 99%?
Nu.
Aceasta este o distincție importantă.
Puritatea HPLC descrie de obicei proporția relativă a componentelor cromatografice detectate.
Conținutul de peptide descrie cantitatea de peptidă propriu-zisă prezentă în raport cu materialul total.
De exemplu, un flacon liofilizat poate conține:
- peptida dorită;
- apă;
- contraioni;
- săruri;
- excipienți.
Aceste componente nu sunt măsurate neapărat toate în același mod în timpul unei analize HPLC standard.
Prin urmare, o probă poate avea o puritate cromatografică ridicată, în timp ce conținutul total de peptide este mai mic decât procentul HPLC.
Pentru determinarea cantitativă sunt necesare metode analitice suplimentare.
Ce este analiza cantitativă a peptidelor?
O analiză cantitativă este utilizată pentru a determina cantitatea sau concentrația unei componente specifice.
În funcție de obiectivul cercetării, pot fi utilizate diferite metode.
Exemplele includ:
- HPLC cantitativă cu standard de referință;
- analiza aminoacizilor;
- analiza azotului;
- tehnici spectroscopice;
- calcule ale bilanțului de masă.
O analiză cantitativă răspunde unei întrebări diferite față de o analiză standard a purității.
Analiza purității necesită:
Ce parte dintre componentele peptidice detectate aparține vârfului principal?
O analiză cantitativă necesită:
Cât de multă peptidă dorită este prezentă efectiv?
Ambele date pot fi relevante pentru caracterizarea completă a calității.
De ce este importantă spectrometria de masă?
Spectrometria de masă, prescurtată adesea MS, măsoară raportul masă-sarcină al moleculelor ionizate.
În analiza peptidelor se poate verifica dacă masa moleculară măsurată corespunde masei teoretice preconizate.
Spectrometria de masă poate contribui la:
- confirmarea identității;
- detectarea anumitor modificări;
- analiza produselor de degradare;
- compararea variantelor de peptide.
Atunci când masa măsurată corespunde masei așteptate, acest lucru susține identificarea.
Cu toate acestea, spectrometria de masă nu oferă automat informații complete despre:
- procentul de puritate;
- cantitatea exactă;
- sterilitatea;
- endotoxine;
- activitatea biologică.
De aceea, HPLC și spectrometria de masă se completează reciproc.
Ce este LC-MS?
LC-MS combină cromatografia lichidă cu spectrometria de masă.
Mai întâi, componentele sunt separate cromatografic. Apoi, semnalele individuale sunt investigate în continuare prin spectrometrie de masă.
Această combinație poate oferi informații despre:
- timpul de retenție;
- masa moleculară;
- posibile impurități;
- produși de degradare;
- modificări chimice.
Prin urmare, LC-MS poate oferi mai multe informații analitice decât o singură tehnică.
Calitatea rezultatelor rămâne dependentă de:
- pregătirea probei;
- setările instrumentului;
- validarea metodei;
- materiale de referință;
- interpretarea de către experți.
De ce pot măsura laboratoare diferite rezultate diferite?
Aceeași peptidă poate produce rezultate ușor diferite în laboratoare diferite.
Cauzele posibile sunt:
- coloane HPLC diferite;
- alte faze mobile;
- gradienți diferiți;
- alte lungimi de undă de detecție;
- diferențe în pregătirea probei;
- alte setări de integrare;
- variația instrumentului.
O diferență nu înseamnă automat că una dintre analize este incorectă.
Pentru a compara corect rezultatele, trebuie analizată și metoda analitică.
Un procent fără informații despre metodă oferă doar un context limitat.
Ce este validarea metodei?
O metodă analitică trebuie să fie demonstrabil adecvată scopului propus.
Aceasta se numește validarea metodei.
Caracteristicile posibile ale validării sunt:
- specificitatea;
- acuratețea;
- precizia;
- linearitatea;
- intervalul de măsurare;
- limita de detecție;
- limita de cuantificare;
- robustețea.
O metodă pentru identificare nu este automat potrivită pentru cuantificarea exactă.
De aceea, trebuie clarificat în prealabil ce întrebare analitică este investigată.
Ce este limita de detecție?
Fiecare metodă analitică are un prag sub care o componentă nu poate fi detectată în mod fiabil.
Aceasta se numește limită de detecție.
Prin urmare, o componentă care nu este vizibilă într-o cromatogramă nu este automat complet absentă.
Concentrația poate fi mai mică decât limita de detecție.
În plus, anumite substanțe pot:
- să nu reacționeze la detectorul utilizat;
- să se afle în afara intervalului de măsurare;
- să se piardă în timpul pregătirii probei;
- să fie separate insuficient.
Prin urmare, afirmația „nedetectat” nu înseamnă întotdeauna „absent”.
Poate fi manipulată o cromatogramă?
O cromatogramă trebuie să conțină suficiente informații pentru a putea fi evaluată profesional.
Datele importante sunt:
- denumirea produsului;
- numărul lotului;
- data analizei;
- metoda utilizată;
- setările detectorului;
- timpii de retenție;
- integrarea vârfurilor;
- date de laborator.
Doar o imagine cu un singur vârf mare și un procent oferă posibilități limitate de verificare.
De asemenea, setările de integrare pot influența semnalele incluse în calcul.
Prin urmare, raportarea transparentă este importantă.
Ce informații ar trebui să figureze pe un COA de încredere?
Un certificat de analiză poate conține, printre altele:
- numele peptidului;
- secvența de aminoacizi;
- numărul lotului sau al seriei;
- data producției;
- data testării;
- rezultatul HPLC;
- cromatogramă;
- rezultatul spectrometriei de masă;
- masa moleculară teoretică;
- masa moleculară măsurată;
- metodele de analiză utilizate;
- numele laboratorului.
Nu orice COA conține toate componentele.
Informațiile necesare depind de produs și de obiectivul cercetării.
Un COA detaliat poate oferi mai multă transparență, dar fiabilitatea depinde și de calitatea analizei.
Este întotdeauna necesară o puritate ridicată?
Puritatea dorită depinde de obiectivul cercetării.
În unele aplicații analitice, cantități foarte mici de componente secundare pot influența:
- rezultatele măsurătorilor;
- cercetare asupra receptorilor;
- cercetare celulară;
- reproductibilitate.
În acest caz, poate fi de dorit un nivel mai ridicat de puritate.
Cu toate acestea, un procent mai mare nu înseamnă automat că toate celelalte caracteristici de calitate sunt mai bune.
De exemplu, un peptid cu o puritate HPLC de 99,5% poate totuși:
- să conțină o cantitate diferită;
- să fie depozitate necorespunzător;
- să fie identificate insuficient;
- să conțină umiditate reziduală crescută;
- să aibă un ambalaj deteriorat.
Prin urmare, calitatea trebuie evaluată multidimensional.
Puritate și diferențe între loturi
Fiecare lot de producție are propriul traseu de producție și analiză.
Prin urmare, rezultatele privind puritatea pot varia între loturi.
O analiză a unui singur lot nu poate fi utilizată automat ca dovadă pentru toate loturile viitoare.
Analiza specifică lotului sprijină:
- trasabilitate;
- comparație;
- controlul calității;
- investigarea abaterilor.
Prin urmare, numărul lotului de pe flacon trebuie să corespundă numărului de pe certificatul de analiză.
Puritate și stabilitate
O puritate inițială ridicată nu garantează că aceasta se va menține în timpul depozitării pe termen lung.
Procesele posibile de degradare sunt:
- oxidare;
- hidroliză;
- deamidare;
- agregare.
Viteza este influențată de:
- temperatura;
- umiditatea;
- lumina;
- oxigen;
- secvența aminoacizilor;
- ambalajul.
Testarea stabilității poate fi utilizată pentru a urmări modificările profilului cromatografic de-a lungul timpului.
Limitări științifice
Nicio metodă analitică nu oferă de una singură o imagine completă a calității peptidelor.
HPLC poate oferi informații importante despre puritatea cromatografică, dar are limitări.
Un procent HPLC nu dovedește automat:
- identitatea;
- cantitatea exactă de peptide;
- secvența aminoacizilor;
- sterilitatea;
- conținutul de endotoxine;
- activitate biologică;
- stabilitate pe termen lung.
De aceea, sunt combinate mai multe metode analitice.
O evaluare completă a calității poate include:
- HPLC;
- spectrometrie de masă;
- test cantitativ;
- analiza umidității;
- testarea stabilității;
- teste suplimentare specifice produsului.
Rezumat
Puritatea peptidelor este un parametru important de calitate, însă un procent HPLC trebuie interpretat corect.
O valoare de 99% înseamnă de obicei că aproximativ 99% din semnalul cromatografic integrat a fost atribuit vârfului principal.
Aceasta nu înseamnă automat că:
- 99% din greutatea flaconului constă în peptide;
- identitatea este confirmată complet;
- cantitatea declarată este corectă;
- materialul este steril;
- sunt excluse toate impuritățile posibile.
Pentru o evaluare mai amplă a calității, rezultatele HPLC trebuie combinate cu alte date, precum:
- spectrometrie de masă;
- informații despre lot;
- analiza cantitativă;
- datele de depozitare;
- testarea stabilității.
Prin urmare, calitatea peptidelor constă în mai mult decât un singur procent.
Declinarea responsabilității privind cercetarea
Peptidele pentru cercetare de la Peptidera sunt oferite exclusiv pentru Research Use Only (RUO) și sunt destinate cercetării de laborator și aplicațiilor analitice.
Nu este destinat consumului uman sau animal, utilizării diagnostice, aplicațiilor terapeutice sau autoadministrării.
Categorie:
Cunoștințe despre peptide și controlul calității
Produse Peptidera asociate:
Peptide de cercetare liofilizate cu identificarea lotului și date analitice de calitate disponibile
Bloguri interne asociate:
- PB-0227 — Peptide liofilizate și liofilizare
- PB-0228 — Flacoanele de peptide și integritatea ambalajului
- PB-0229 — Numerele loturilor și trasabilitatea
- Ce este un certificat de analiză?
- Cum sunt testate analitic peptidele pentru cercetare?
Sugestii de linkuri interne:
- Link către PB-0229 privind analiza specifică lotului
- Link către pagina COA privind certificatele de analiză
- Link către PB-0227 privind stabilitatea și degradarea
- Link către colecția de peptide pentru cercetare
- Link către pagina despre testarea în laboratoare independente
Numele fișierului imagine:PB-0230-peptidezuiverheid-hplc-analyse.jpg