Peptitlerde amino asit analizi açıklaması
Peptitlerde amino asit analizi: bileşim ve miktar belirleme açıklaması
Peptitler amino asit zincirlerinden oluşur. Bu amino asitlerin dizilişi, bir peptidin kimyasal ve yapısal özelliklerinin büyük bir bölümünü belirler.
Kalite incelemelerinde saflığı ve moleküler kütleyi değerlendirmek için HPLC ve kütle spektrometrisi gibi teknikler sıklıkla kullanılır. Tamamlayıcı bir analiz yöntemi de genellikle AAA olarak kısaltılan amino asit analizidir.
Amino asit analizi şu amaçlarla kullanılabilir:
- bir numunede hangi amino asitlerin bulunduğu;
- ölçülen amino asit oranlarının beklenen bileşimle nasıl örtüştüğü;
- ne kadar peptit bulunduğu;
- amino asit bileşiminin teorik peptitle uyuşup uyuşmadığı;
- net peptit içeriğinin nasıl hesaplanabileceği.
Bu yöntem HPLC ve kütle spektrometrisinden farklı çalışır. Klasik amino asit analizinde peptit zinciri önce ayrı amino asitlere parçalanır. Daha sonra bu amino asitler ayrılır, tespit edilir ve miktarları belirlenir.
Amino asit analizi değerli bilgiler sağlayabilir, ancak bazı sınırlamaları da vardır. Parçalanma sırasında bazı amino asitler kısmen değişebilir veya kaybolabilir. Bu nedenle sonuçlar her zaman kullanılan yöntemin bağlamı içinde yorumlanmalıdır.
Amino asit analizi nedir?
Amino asit analizi, bir numunenin amino asit bileşimini incelemek için kullanılan bir laboratuvar tekniğidir.
Klasik bir analizde genellikle şu adımlar uygulanır:
- numune hazırlama;
- peptit zincirinin hidrolizi;
- ayrı amino asitlerin açığa çıkarılması;
- amino asitlerin ayrılması;
- tespit ve miktar belirleme;
- beklenen bileşimle karşılaştırma.
Sonuç şu şekilde ifade edilebilir:
- amino asit başına miktar;
- mol oranı;
- kütle konsantrasyonu;
- amino asit profili;
- hesaplanan peptit içeriği.
Hidroliz nedir?
Hidroliz, bağların su kullanılarak parçalandığı kimyasal bir süreçtir.
Amino asit analizinde, ayrı amino asitlerin açığa çıkması için peptit bağları parçalanır.
Yaygın olarak kullanılan bir yöntem asit hidrolizidir.
Bu sırada numune, kontrollü bir süre boyunca şu koşullara maruz bırakılır:
- kuvvetli asit;
- yüksek sıcaklık;
- kontrollü koşullar.
Hidrolizden sonra özgün peptit zinciri artık bozulmamış bir molekül olarak var olmaz.
Açığa çıkan amino asitler daha sonra ayrı ayrı incelenebilir.
Peptit zinciri neden parçalanır?
Bozulmamış bir peptit onlarca farklı amino asit kalıntısı içerebilir.
Zincir parçalanarak her amino asidin toplam miktarı ölçülebilir.
Teorik olarak bir peptidin şunları içerdiğini varsayalım:
- dört alanin kalıntısı;
- iki glisin kalıntısı;
- üç lösin kalıntısı;
- bir tirozin kalıntısı.
Hidrolizden sonra ölçülen oranların bu teorik bileşimle yaklaşık olarak uyuşup uyuşmadığı incelenebilir.
Bu, amino asit bileşiminin değerlendirilmesini destekler.
Amino asit bileşimi ile amino asit dizisi arasındaki fark nedir?
Amino asidi analizi esas olarak hangi amino asitlerin bulunduğunu ve miktarlarını ölçer.
Yöntem, kesin sırayı otomatik olarak belirlemez.
İki farklı peptit aynı amino asit bileşimine, ancak farklı bir sıraya sahip olabilir.
Örneğin:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Her ikisi de şunları içerir:
- bir alanin;
- bir glisin;
- bir lösin.
Yine de dizi farklıdır.
Dizi analizi için aşağıdakiler gibi başka teknikler gerekir:
- tandem kütle spektrometrisi;
- fragman analizi;
- özgül dizileme yöntemleri.
Amino asidi analizi kimliği doğrulayabilir mi?
Amino asidi analizi, beklenen bileşimi destekleyebilir.
Ölçülen amino asit profili teorik bileşimden büyük ölçüde saparsa, bu durum ek inceleme yapılmasını gerektirebilir.
Ancak eşleşen bir profil, kesin amino asit dizisinin doğru olduğunu tek başına kanıtlamaz.
Daha kapsamlı bir kimlik değerlendirmesi için şunlar birleştirilebilir:
- moleküler kütle;
- LC-MS;
- MS/MS;
- amino asidi analizi;
- kromatografik veriler.
Amino asitler nasıl ayrılır?
Hidrolizden sonra numune, serbest amino asitlerin bir karışımını içerir.
Bunların analitik olarak birbirinden ayrılması gerekir.
Olası teknikler şunlardır:
- iyon değişim kromatografisi;
- HPLC;
- UPLC;
- kapiler elektroforez.
Seçilen teknik şunlara bağlıdır:
- istenen hassasiyet;
- laboratuvar yöntemi;
- numune türü;
- gereken doğruluk.
Türevlendirme nedir?
Birçok amino asidin ek işlem uygulanmadan tespit edilebilirliği sınırlıdır.
Bu nedenle tespit edilebilir bir gruba kimyasal olarak bağlanabilirler.
Buna türevlendirme denir.
Türevlendirme şu aşamalarda gerçekleştirilebilir:
- kromatografik ayırmadan önce;
- kromatografik ayırmadan sonra.
Oluşan türevler, örneğin şu yöntemlerle daha iyi ölçülebilir:
- UV tespiti;
- floresans tespiti;
- kütle spektrometrisi.
Kolon öncesi türevlendirme
Kolon öncesi türevlendirmede amino asitler, kromatografik ayırmadan önce etiketlenir.
Daha sonra oluşan türevler bir kolon aracılığıyla ayrılır.
Olası avantajlar şunlardır:
- yüksek hassasiyet;
- uygun floresans tespiti;
- birden fazla amino asidin analizi.
Reaksiyon tekrarlanabilir şekilde gerçekleşmelidir.
Eksik türevlendirme, miktar tayinini etkileyebilir.
Kolon sonrası türevlendirme
Kolon sonrası türevlendirmede amino asitler önce ayrılır.
Kolondan sonra amino asitler bir tespit reaktifiyle tepkimeye girer.
Bilinen bir örnek ninhidrin analizidir.
Oluşan reaksiyon ürünleri daha sonra optik olarak ölçülebilir.
Amino asit miktarı nasıl belirlenir?
Miktar tayini için referans standartlar kullanılır.
Standart çözeltiler bilinen miktarlarda amino asit içerir.
Bunlar, aşağıdakiler arasındaki ilişkiyi belirlemek için ölçülür:
- konsantrasyon;
- dedektör sinyali.
Ardından bilinmeyen numune ölçülür.
Kalibrasyon verileri kullanılarak her amino asidin miktarı hesaplanabilir.
İç standart nedir?
İç standart, numunelere ve kalibrasyon çözeltilerine eklenen bilinen bir maddedir.
Bu, aşağıdaki süreçlerdeki değişkenliği düzeltmeye yardımcı olabilir:
- numune hazırlama;
- enjeksiyon;
- türevleştirme;
- analiz.
İç standart, incelenen amino asitlerden analitik olarak kolayca ayırt edilebilmelidir.
Amino asit analizi peptit miktarını nasıl belirleyebilir?
Bir peptidin amino asit bileşimi bilindiğinde, peptit miktarını hesaplamak için seçilmiş amino asitler kullanılabilir.
Her peptit zincirinin tam olarak dört alanin kalıntısı içerdiğini varsayalım.
Toplam alanin miktarı ölçüldüğünde, mevcut peptit zincirlerinin sayısı buradan tahmin edilebilir.
Hesaplama şunları dikkate alır:
- peptit başına düşen kalıntı sayısı;
- moleküler kütle;
- ölçülen amino asit miktarı;
- analiz yöntemi.
Bu, kantitatif bir peptit tayini için kullanılabilir.
Neden her zaman tüm amino asitler kullanılmaz?
Her amino asit miktar tayini için eşit derecede uygun değildir.
Bazı amino asitler hidroliz sırasında:
- kısmen parçalanabilir;
- kimyasal olarak değişebilir;
- tam olarak serbestleşmeyebilir;
- güvenilir şekilde ölçülmesi zorlaşabilir.
Bu nedenle genellikle kararlı amino asitler seçilir.
Seçim, peptit dizisine ve analiz yöntemine bağlıdır.
Hidroliz sırasında hangi amino asitler değişebilir?
Asit hidrolizi çeşitli etkilere yol açabilir.
Triptofan
Triptofan standart asit hidrolizi sırasında büyük ölçüde parçalanabilir.
Bu nedenle triptofanın spesifik olarak ölçülmesi gerektiğinde uyarlanmış yöntemler gerekir.
Asparajin
Asparajin hidroliz sırasında aspartata dönüştürülebilir.
Bu nedenle asparajin ve aspartat klasik analizde her zaman ayrı ayrı raporlanmaz.
Glutamin
Glutamin glutamata dönüştürülebilir.
Böylece glutamin ve glutamat birlikte gösterilebilir.
Serin
Serin, uzun süreli hidroliz sırasında kısmen kaybolabilir.
Treonin
Treonin de kısmen bozunabilir.
Sistein
Sistein oksidatif değişikliklere uğrayabilir.
Güvenilir analiz için önceden oksidasyon veya uyarlanmış bir yöntem gerekebilir.
Hidroliz süresi neden önemlidir?
Peptit bağlarının yeterince parçalanması gerekir.
Çok kısa süren hidroliz şuna yol açabilir:
- eksik parçalanma;
- ölçülen amino asit değerlerinin çok düşük olması.
Çok uzun süren hidroliz şuna yol açabilir:
- hassas amino asitlerin daha fazla parçalanması;
- ölçüm kaybı.
Bu nedenle hidroliz süresi ve sıcaklığı kontrol edilir.
Bazen kaybı veya eksik parçalanmayı incelemek için birden fazla hidroliz süresi kullanılır.
Molar oran nedir?
Molar oran, amino asitlerin göreli sayılarını tanımlar.
Bir peptidin teorik olarak şunları içerdiğini varsayalım:
- iki alanin;
- bir glisin;
- üç lösin.
Teorik molar oran:
2 : 1 : 3
Analizden sonra ölçülen değerler normalize edilebilir.
Oran teorik değere yakın olduğunda, beklenen amino asit bileşimini destekler.
Küçük sapmalar şu nedenlerle ortaya çıkabilir:
- ölçüm belirsizliği;
- hidroliz kaybı;
- türevleştirme;
- kromatografik piklerin integrasyonu.
Normalizasyon ne anlama gelir?
Normalizasyonda ölçülen amino asit değerleri göreli oranlara dönüştürülür.
Uygun bir amino asit referans olarak kullanılabilir.
Bu sayede ölçülen profil teorik bileşimle karşılaştırılabilir.
Normalizasyon bileşim araştırması için yararlıdır, ancak mutlak peptit miktarını otomatik olarak vermez.
Amino asit analizi ve HPLC saflığı karşılaştırması
HPLC saflığı ve amino asit analizi farklı özellikleri ölçer.
HPLC saflığı genellikle şunu inceler:
- kromatografik ana pik;
- ikincil piklerin göreli miktarı.
Amino asit analizi şunları inceler:
- amino asit bileşimi;
- seçilen amino asitlerin miktarı;
- olası peptit miktar tayini.
Yüksek HPLC saflığı, amino asit bileşiminin doğru olduğunu otomatik olarak kanıtlamaz.
Uygun bir amino asit bileşimi, peptitle ilişkili safsızlıkların bulunmadığını otomatik olarak kanıtlamaz.
Teknikler birbirini tamamlar.
Amino asit analizi ve kütle spektrometrisi karşılaştırması
Kütle spektrometrisi, moleküllerin kütle-yük oranını inceler.
Bütün molekül kütlesi ölçümü, moleküler kütlenin teorik değerle uyumlu olduğunu destekleyebilir.
Amino asit analizi, parçalanma sonrasında amino asitlerin miktarını ve oranını inceler.
Her iki tekniğin de farklı güçlü yönleri vardır.
Bir kombinasyon şu konular hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir:
- kimlik;
- bileşim;
- peptit içeriği.
Amino asit analizi ile peptit miktar tayini karşılaştırması
Amino asit analizi, miktar tayini yöntemi olarak kullanılabilir.
Bir peptit miktar tayini şu amacı açıklar:
peptit miktarını belirlemek.
Amino asit analizi, bu amaca ulaşmak için kullanılabilecek tekniklerden biridir.
Diğer olası miktar tayini yöntemleri şunlardır:
- kantitatif HPLC;
- UV spektrofotometrisi;
- LC-MS miktar tayini;
- kütle dengesi.
Karşı iyonların etkisi nedir?
Karşı iyonlar, örneğin:
- asetat;
- klorür;
- TFA;
dondurarak kurutulmuş malzemenin toplam kütlesine katkıda bulunur.
Amino asit analizinde esas olarak peptidin amino asit bileşenleri incelenir.
Böylece yöntem şu ayrımı yapmaya yardımcı olabilir:
- toplam malzeme kütlesi;
- gerçek peptit miktarı.
Tam bir kütle dengesi için ek analizler gerekebilir.
Kalan nemin etkisi nedir?
Kalan nem toplam ağırlığa katkıda bulunur, ancak amino asit bileşimine katkıda bulunmaz.
Net peptit içeriği hesaplanırken nem analizi ek bilgi sağlayabilir.
Kapsamlı bir kütle dengesi şunlardan oluşabilir:
- peptit içeriği;
- su içeriği;
- karşı iyon içeriği;
- diğer bileşenler.
Amino asit analizi kontaminasyonları gösterebilir mi?
Bazı anormal amino asit sinyalleri beklenmeyen bileşenlere işaret edebilir.
Ancak yöntem, olası her kontaminasyonu tespit etmek üzere tasarlanmamıştır.
Şunlar için başka teknikler gerekebilir:
- organik safsızlıklar;
- kalıntı çözücüler;
- metaller;
- mikrobiyolojik kontaminasyon;
- endotoksinler.
Bir COA'da neler bulunabilir?
Bir analiz sertifikası şu tür bilgileri içerebilir:
- test: amino asit analizi;
- analiz yöntemi;
- ölçülen amino asit oranları;
- teorik oranlar;
- hesaplanan peptit içeriği;
- test tarihi;
- parti numarası.
Her COA amino asit analizi içermez.
Yalnızca HPLC ve MS gerçekleştirildiğinde, bunlardan tam amino asit miktar tayini yapılamaz.
Parti bağlantısı neden önemlidir?
Bir amino asit analizi, incelenen partiyle ilişkilendirilmelidir.
Önemli veriler şunlardır:
- lot numarası;
- ürün adı;
- analiz tarihi;
- laboratuvar;
- analiz yöntemi.
Açık bir parti bağlantısı olmayan analiz raporunun izlenebilirlik açısından değeri daha düşüktür.
Ölçüm belirsizliği ne anlama gelir?
Her kantitatif analiz ölçüm belirsizliği içerir.
Amino asit analizinde değişkenlik kaynakları şunlar olabilir:
- numune hazırlama;
- hidroliz;
- amino asit kaybı;
- türevleştirme;
- kalibrasyon;
- kromatografik ayırma;
- pik entegrasyonu.
Bu nedenle sonuçlar mutlak olarak hatasız kabul edilmemelidir.
Yöntem doğrulaması neden önemlidir?
Bir yöntem, amaçlanan hedefe uygun olmalıdır.
Nicel amino asit analizinde ilgili validasyon özellikleri şunlar olabilir:
- doğruluk;
- kesinlik;
- doğrusallık;
- özgüllük;
- ölçüm aralığı;
- sağlamlık;
- tekrarlanabilirlik.
Nitel bir amino asit profili için uygun olan bir yöntem, otomatik olarak kesin peptit miktar tayini için yeterli değildir.
Bilimsel sınırlamalar
Amino asit analizinin önemli sınırlamaları vardır.
Yöntem tek başına şunları belirlemez:
- kesin amino asit dizisi;
- moleküler kütle;
- HPLC saflığı;
- üç boyutlu yapı;
- biyolojik aktivite;
- sterilite;
- endotoksin düzeyi.
Ayrıca bazı amino asitler hidroliz sırasında değişime uğrayabilir.
Kapsamlı bir kalite değerlendirmesi için birden fazla analiz tekniği bir arada kullanılmalıdır.
Özet
Amino asit analizi, bir peptitteki amino asitlerin bileşimini ve miktarını inceler.
Klasik analizde peptit zinciri önce hidroliz yoluyla parçalanır.
Ardından amino asitler:
- ayrıştırılır;
- tespit edilir;
- miktarı belirlenir;
- teorik bileşimle karşılaştırılır.
Amino asit analizi şu amaçlarla kullanılabilir:
- amino asit bileşiminin kontrolü;
- mol oranlarının değerlendirilmesi;
- peptit içeriğinin miktar tayini;
- kimlik doğrulama desteği.
Yöntemin sınırlamaları vardır; çünkü bazı amino asitler hidroliz sırasında değişime uğrayabilir.
Bu nedenle amino asit analizi tercihen şunlarla birlikte kullanılır:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- peptit tayini;
- artık nem analizi;
- karşı iyon analizi.
Araştırma sorumluluk reddi
Peptidera araştırma peptitleri yalnızca Research Use Only (RUO) amacıyla sunulur ve laboratuvar araştırmaları ile analitik uygulamalara yöneliktir.
İnsan veya hayvan tüketimi, tanısal kullanım, terapötik uygulama ya da kendi kendine uygulama için değildir.
Peptit bilgisi & kalite kontrolü
İlgili Peptidera ürünleri:
Parti tanımlaması ve mevcut analitik kalite verileriyle liyofilize araştırma peptitleri
İlgili dahili bloglar:
- PB-0230 — Peptit saflığı ve HPLC
- PB-0231 — Peptitlerde kütle spektrometrisi
- PB-0233 — Peptit tayini: saflık ve peptit içeriği karşılaştırması
- PB-0234 — Liyofilize peptitlerde artık nem
- PB-0238 — Peptitlerde karşı iyonlar
Dahili bağlantı önerileri:
- Peptit tayini olarak amino asit analiziyle ilgili PB-0233'e bağlantı
- HPLC saflığıyla farkıyla ilgili PB-0230'a bağlantı
- Moleküler kütle ve dizi analiziyle ilgili PB-0231'e bağlantı
- Artık nem ve net peptit içeriğiyle ilgili PB-0234'e bağlantı
- Karşı iyonlar ve kütle dengesiyle ilgili PB-0238'e bağlantı
- Analiz sertifikalarının bulunduğu Peptidera sayfasına bağlantı
- Araştırma peptitleri koleksiyonuna bağlantı