Analýza aminokyselín pri peptidoch vysvetlená
Analýza aminokyselín v peptidoch: vysvetlenie zloženia a kvantifikácie
Peptidy pozostávajú z reťazcov aminokyselín. Poradie týchto aminokyselín určuje veľkú časť chemických a štrukturálnych vlastností peptidu.
Pri kontrole kvality sa na posúdenie čistoty a molekulovej hmotnosti často používajú techniky, ako sú HPLC a hmotnostná spektrometria. Doplnkovou analytickou metódou je analýza aminokyselín, často označovaná skratkou AAA.
Analýzu aminokyselín možno použiť na skúmanie:
- ktoré aminokyseliny sú vo vzorke prítomné;
- ako namerané pomery aminokyselín zodpovedajú očakávanému zloženiu;
- koľko peptidu je prítomného;
- či aminokyselinové zloženie zodpovedá teoretickému peptidu;
- ako možno vypočítať čistý obsah peptidu.
Táto metóda funguje inak ako HPLC a hmotnostná spektrometria. Pri klasickej analýze aminokyselín sa peptidový reťazec najprv rozloží na jednotlivé aminokyseliny. Tie sa potom separujú, detegujú a kvantifikujú.
Analýza aminokyselín môže poskytnúť cenné informácie, ale má aj obmedzenia. Počas rozkladu sa niektoré aminokyseliny môžu čiastočne zmeniť alebo stratiť. Preto sa výsledky musia vždy interpretovať v kontexte použitej metódy.
Čo je analýza aminokyselín?
Analýza aminokyselín je laboratórna technika, pomocou ktorej sa skúma aminokyselinové zloženie vzorky.
Pri klasickej analýze sa zvyčajne vykonávajú tieto kroky:
- príprava vzorky;
- hydrolýza peptidového reťazca;
- uvoľnenie jednotlivých aminokyselín;
- separácia aminokyselín;
- detekcia a kvantifikácia;
- porovnanie s očakávaným zložením.
Výsledok možno vyjadriť ako:
- množstvo jednotlivých aminokyselín;
- molárny pomer;
- hmotnostná koncentrácia;
- aminokyselinový profil;
- vypočítaný obsah peptidu.
Čo je hydrolýza?
Hydrolýza je chemický proces, pri ktorom sa väzby štiepia pomocou vody.
Pri analýze aminokyselín sa peptidové väzby rozkladajú, čím sa uvoľňujú jednotlivé aminokyseliny.
Bežne používanou metódou je kyslá hydrolýza.
Vzorka sa pritom počas kontrolovaného obdobia vystaví:
- silná kyselina;
- zvýšená teplota;
- kontrolované podmienky.
Po hydrolýze už pôvodný peptidový reťazec neexistuje ako intaktná molekula.
Uvoľnené aminokyseliny možno následne skúmať jednotlivo.
Prečo sa peptidový reťazec rozkladá?
Intaktný peptid môže obsahovať desiatky rôznych aminokyselinových zvyškov.
Rozštiepením reťazca možno zmerať celkové množstvo každej aminokyseliny.
Predstavme si, že teoretický peptid obsahuje:
- štyri alanínové rezíduá;
- dve glycínové rezíduá;
- tri leucínové rezíduá;
- jedno tyrozínové rezíduum.
Po hydrolýze možno preskúmať, či namerané pomery približne zodpovedajú tomuto teoretickému zloženiu.
To podporuje posúdenie aminokyselinového zloženia.
Aký je rozdiel medzi aminokyselinovým zložením a poradím aminokyselín?
Analýza aminokyselín meria predovšetkým ktoré aminokyseliny sú prítomné a v akom množstve.
Metóda automaticky neurčuje presné poradie.
Dva rôzne peptidy môžu mať rovnaké aminokyselinové zloženie, ale odlišné poradie.
Napríklad:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Obe obsahujú:
- jedna alanínová jednotka;
- jeden glycín;
- jedna leucínová jednotka.
Napriek tomu je sekvencia odlišná.
Na skúmanie sekvencie sú potrebné iné techniky, napríklad:
- tandemová hmotnostná spektrometria;
- fragmentová analýza;
- špecifické sekvenačné metódy.
Môže analýza aminokyselín potvrdiť identitu?
Analýza aminokyselín môže podporiť očakávané zloženie.
Ak sa nameraný profil aminokyselín výrazne líši od teoretického zloženia, môže to byť dôvodom na ďalšie skúmanie.
Zhodný profil však sám osebe nedokazuje, že presné poradie aminokyselín je správne.
Na širšie posúdenie identity možno kombinovať:
- molekulová hmotnosť;
- LC-MS;
- MS/MS;
- analýza aminokyselín;
- chromatografické údaje.
Ako sa aminokyseliny separujú?
Po hydrolýze vzorka obsahuje zmes voľných aminokyselín.
Tie sa musia od seba analyticky separovať.
Možné techniky sú:
- iónomeničová chromatografia;
- HPLC;
- UPLC;
- kapilárna elektroforéza.
Zvolená technika závisí od:
- požadovaná citlivosť;
- laboratórna metóda;
- typ vzorky;
- požadovaná presnosť.
Čo je derivatizácia?
Mnohé aminokyseliny majú bez dodatočnej úpravy obmedzenú detegovateľnosť.
Preto ich možno chemicky spojiť s detegovateľnou skupinou.
Toto sa nazýva derivatizácia.
Derivatizácia môže prebiehať:
- pred chromatografickou separáciou;
- po chromatografickej separácii.
Vzniknuté deriváty možno lepšie merať napríklad pomocou:
- UV detekcia;
- fluorescenčná detekcia;
- hmotnostná spektrometria.
Predkolónová derivatizácia
Pri predkolónovej derivatizácii sa aminokyseliny označia pred chromatografickou separáciou.
Potom sa vzniknuté deriváty separujú pomocou kolóny.
Možné výhody sú:
- vysoká citlivosť;
- vhodná fluorescenčná detekcia;
- analýza viacerých aminokyselín.
Reakcia musí prebiehať reprodukovateľne.
Neúplná derivatizácia môže ovplyvniť kvantifikáciu.
Postkolónová derivatizácia
Pri postkolónovej derivatizácii sa aminokyseliny najprv oddelia.
Po prechode kolónou reagujú s detekčným činidlom.
Známym príkladom je analýza s ninhydrínom.
Vzniknuté reakčné produkty možno následne opticky zmerať.
Ako sa určuje množstvo aminokyseliny?
Na kvantifikáciu sa používajú referenčné štandardy.
Štandardné roztoky obsahujú známe množstvá aminokyselín.
Tieto sa merajú s cieľom stanoviť vzťah medzi:
- koncentrácia;
- signál detektora.
Potom sa zmeria neznáma vzorka.
Pomocou kalibračných údajov možno vypočítať množstvo každej aminokyseliny.
Čo je interný štandard?
Interný štandard je známa látka, ktorá sa pridáva do vzoriek a kalibračných roztokov.
Môže pomôcť korigovať variácie počas:
- príprava vzorky;
- injekcie;
- derivatizácia;
- analýza.
Interný štandard musí byť analyticky dobre odlíšiteľný od skúmaných aminokyselín.
Ako môže analýza aminokyselín určiť obsah peptidu?
Keď je známe aminokyselinové zloženie peptidu, na výpočet množstva peptidu možno použiť vybrané aminokyseliny.
Predpokladajme, že každý peptidový reťazec obsahuje presne štyri alanínové rezíduá.
Keď sa zmeria celkové množstvo alanínu, možno z neho odhadnúť, koľko peptidových reťazcov bolo prítomných.
Výpočet zohľadňuje:
- počet rezíduí na peptid;
- molekulová hmotnosť;
- namerané množstvo aminokyseliny;
- analytická metóda.
Toto možno použiť na kvantitatívny peptidový test.
Prečo sa nepoužívajú vždy všetky aminokyseliny?
Nie každá aminokyselina je rovnako vhodná na kvantifikáciu.
Niektoré aminokyseliny môžu počas hydrolýzy:
- čiastočne sa rozložiť;
- chemicky sa meniť;
- neúplne sa uvoľniť;
- ťažko spoľahlivo zmerať.
Preto sa často vyberajú stabilné aminokyseliny.
Výber závisí od sekvencie peptidu a analytickej metódy.
Ktoré aminokyseliny sa môžu počas hydrolýzy meniť?
Kyslá hydrolýza môže mať rôzne účinky.
Tryptofán
Tryptofán sa môže počas štandardnej kyslej hydrolýzy z väčšej časti rozložiť.
Preto sú potrebné upravené metódy, keď je potrebné špecificky merať tryptofán.
Asparagín
Asparagín sa môže počas hydrolýzy premeniť na aspartát.
Preto sa asparagín a aspartát pri klasickej analýze nie vždy uvádzajú samostatne.
Glutamín
Glutamín sa môže premeniť na glutamát.
Vďaka tomu možno glutamín a glutamát zobraziť spoločne.
Serine
Serín sa môže počas dlhodobej hydrolýzy čiastočne stratiť.
Treonín
Aj treonín môže čiastočne degradovať.
Cysteín
Cysteín môže podliehať oxidačným zmenám.
Na spoľahlivú analýzu môže byť potrebná predchádzajúca oxidácia alebo upravená metóda.
Prečo je čas hydrolýzy dôležitý?
Peptidové väzby sa musia dostatočne rozložiť.
Príliš krátka hydrolýza môže viesť k:
- neúplný rozklad;
- príliš nízke namerané hodnoty aminokyselín.
Príliš dlhá hydrolýza môže viesť k:
- ďalší rozklad citlivých aminokyselín;
- straty pri meraní.
Preto sa čas a teplota hydrolýzy kontrolujú.
Niekedy sa používajú viaceré časy hydrolýzy na skúmanie strát alebo neúplného rozkladu.
Čo je molárny pomer?
Molárny pomer opisuje relatívne počty aminokyselín.
Predpokladajme, že peptid teoreticky obsahuje:
- dva alaníny;
- jeden glycín;
- tri leucíny.
Teoretický molárny pomer je:
2 : 1 : 3
Po analýze možno namerané hodnoty normalizovať.
Keď sa pomer blíži k teoretickej hodnote, podporuje to predpokladané zloženie aminokyselín.
Malé odchýlky môžu vzniknúť v dôsledku:
- neistota merania;
- straty pri hydrolýze;
- derivatizácia;
- integrácia chromatografických píkov.
Čo znamená normalizácia?
Pri normalizácii sa namerané hodnoty aminokyselín prepočítavajú na relatívne pomery.
Ako referencia sa môže použiť vhodná aminokyselina.
Vďaka tomu možno nameraný profil porovnať s teoretickým zložením.
Normalizácia je užitočná na skúmanie zloženia, ale automaticky neposkytuje absolútne množstvo peptidu.
Čistota stanovená pomocou HPLC verzus analýza aminokyselín
Čistota stanovená pomocou HPLC a analýza aminokyselín merajú odlišné vlastnosti.
Čistota stanovená pomocou HPLC zvyčajne skúma:
- hlavný chromatografický pík;
- relatívne množstvo vedľajších píkov.
Analýza aminokyselín skúma:
- zloženie aminokyselín;
- množstvo vybraných aminokyselín;
- možná kvantifikácia peptidu.
Vysoká čistota stanovená pomocou HPLC automaticky nedokazuje, že zloženie aminokyselín je správne.
Zodpovedajúce zloženie aminokyselín automaticky nedokazuje, že nie sú prítomné nečistoty súvisiace s peptidmi.
Techniky sa navzájom dopĺňajú.
Analýza aminokyselín verzus hmotnostná spektrometria
Hmotnostná spektrometria skúma pomer hmotnosti a náboja molekúl.
Meranie intaktnej hmotnosti môže podporiť potvrdenie, že molekulová hmotnosť zodpovedá teoretickej hodnote.
Analýza aminokyselín skúma množstvo a pomer aminokyselín po hydrolýze.
Obe techniky majú rôzne silné stránky.
Kombinácia môže poskytnúť viac informácií o:
- identita;
- zloženie;
- obsah peptidu.
Analýza aminokyselín verzus stanovenie peptidu
Analýzu aminokyselín možno použiť aj ako metódu stanovenia.
Peptidový test opisuje cieľ:
určiť množstvo peptidu.
Analýza aminokyselín je jednou z techník, pomocou ktorých možno tento cieľ dosiahnuť.
Ďalšie možné metódy stanovenia sú:
- kvantitatívna HPLC;
- UV-spektrofotometria;
- kvantifikácia pomocou LC-MS;
- hmotnostná bilancia.
Aký vplyv majú protiióny?
Protiióny, ako napríklad:
- acetát;
- chlorid;
- TFA;
prispievajú k celkovej hmotnosti lyofilizovaného materiálu.
Pri analýze aminokyselín sa skúmajú najmä aminokyselinové zložky peptidu.
Vďaka tomu môže metóda pomôcť rozlíšiť medzi:
- celková hmotnosť materiálu;
- skutočné množstvo peptidu.
Na úplnú hmotnostnú bilanciu môžu byť potrebné ďalšie analýzy.
Aký vplyv má zvyšková vlhkosť?
Zvyšková vlhkosť prispieva k celkovej hmotnosti, ale nie k zloženiu aminokyselín.
Pri výpočte čistého obsahu peptidu môže analýza vlhkosti poskytnúť doplňujúce informácie.
Rozšírená hmotnostná bilancia môže pozostávať z:
- obsah peptidu;
- obsah vody;
- obsah protiiónov;
- ostatné zložky.
Môže analýza aminokyselín preukázať kontamináciu?
Niektoré odchýlne signály aminokyselín môžu poukazovať na neočakávané zložky.
Metóda však nie je navrhnutá na detekciu každej možnej nečistoty.
Na iné účely môžu byť potrebné ďalšie techniky:
- organické nečistoty;
- zvyškové rozpúšťadlá;
- kovy;
- mikrobiologická kontaminácia;
- endotoxíny.
Čo môže byť uvedené v COA?
Certifikát analýzy môže obsahovať napríklad:
- test: analýza aminokyselín;
- analytická metóda;
- namerané pomery aminokyselín;
- teoretické pomery;
- vypočítaný obsah peptidu;
- dátum testu;
- číslo šarže.
Nie každý COA obsahuje analýzu aminokyselín.
Ak sa vykonali iba HPLC a MS, nemožno z toho odvodiť úplnú kvantifikáciu aminokyselín.
Prečo je priradenie k šarži dôležité?
Analýza aminokyselín musí byť priradená k skúmanej šarži.
Dôležité údaje sú:
- číslo šarže;
- názov produktu;
- dátum analýzy;
- laboratórium;
- analytická metóda.
Analytický protokol bez jasného priradenia k šarži má menšiu hodnotu z hľadiska vysledovateľnosti.
Čo znamená neistota merania?
Každá kvantitatívna analýza obsahuje neistotu merania.
Pri analýze aminokyselín môžu byť zdrojmi variability:
- príprava vzorky;
- hydrolýza;
- strata aminokyselín;
- derivatizácia;
- kalibrácia;
- chromatografická separácia;
- integrácia píkov.
Preto by sa výsledky nemali považovať za absolútne bezchybné.
Prečo je validácia metódy dôležitá?
Metóda musí byť vhodná na zamýšľaný účel.
Pri kvantitatívnej analýze aminokyselín môžu byť relevantnými validačnými charakteristikami:
- správnosť;
- presnosť;
- linearita;
- špecificita;
- rozsah merania;
- robustnosť;
- opakovateľnosť.
Metóda vhodná na kvalitatívny profil aminokyselín nie je automaticky dostatočná na presnú kvantifikáciu peptidu.
Vedecké obmedzenia
Analýza aminokyselín má významné obmedzenia.
Metóda samostatne neurčuje:
- presné poradie aminokyselín;
- molekulová hmotnosť;
- čistota podľa HPLC;
- trojrozmerná štruktúra;
- biologická aktivita;
- sterilita;
- obsah endotoxínov.
Okrem toho sa niektoré aminokyseliny môžu počas hydrolýzy zmeniť.
Na komplexné posúdenie kvality je potrebné kombinovať viacero analytických techník.
Zhrnutie
Analýza aminokyselín skúma zloženie a množstvo aminokyselín v peptide.
Pri klasickej analýze sa peptidový reťazec najprv rozštiepi hydrolýzou.
Potom sa aminokyseliny:
- oddelené;
- detegované;
- kvantifikované;
- porovnané s teoretickým zložením.
Analýzu aminokyselín možno použiť na:
- kontrola zloženia aminokyselín;
- posúdenie molárnych pomerov;
- kvantifikácia obsahu peptidu;
- podpora identity.
Metóda má obmedzenia, pretože niektoré aminokyseliny sa môžu počas hydrolýzy zmeniť.
Preto sa analýza aminokyselín prednostne kombinuje s:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- peptidový test;
- analýza zvyškovej vlhkosti;
- analýza protiiónov.
Vyhlásenie o výskumnom použití
Výskumné peptidy Peptidera sa ponúkajú výlučne na účely Research Use Only (RUO) a sú určené na laboratórny výskum a analytické aplikácie.
Nie je určené na ľudskú ani zvieraciu konzumáciu, diagnostické použitie, terapeutické účely ani na samopodávanie.
Peptidové znalosti a kontrola kvality
Súvisiace produkty Peptidera:
Lyofilizované výskumné peptidy s identifikáciou šarže a dostupnými analytickými údajmi o kvalite
Súvisiace interné blogy:
- PB-0230 — Čistota peptidu a HPLC
- PB-0231 — Hmotnostná spektrometria peptidov
- PB-0233 — Peptidový test: čistota verzus obsah peptidu
- PB-0234 — Zvyšková vlhkosť v lyofilizovaných peptidoch
- PB-0238 — Protiióny v peptidoch
Návrhy interných odkazov:
- Odkaz na PB-0233 v súvislosti s analýzou aminokyselín ako peptidovým testom
- Odkaz na PB-0230 v súvislosti s rozdielom oproti čistote podľa HPLC
- Odkaz na PB-0231 v súvislosti s molekulovou hmotnosťou a analýzou sekvencie
- Odkaz na PB-0234 v súvislosti so zvyškovou vlhkosťou a čistým obsahom peptidu
- Odkaz na PB-0238 v súvislosti s protiiónmi a hmotnostnou bilanciou
- Odkaz na stránku Peptidera s certifikátmi analýzy
- Odkaz na kolekciu výskumných peptidov