Hmotnostná spektrometria peptidov vysvetlená

Hmotnostná spektrometria pri peptidoch: ako sa skúma molekulová identita?

Pri kontrole kvality výskumných peptidov sa často kombinuje viacero analytických techník. HPLC môže poskytnúť informácie o chromatografickej čistote, ale vysoký hlavný pík automaticky nedokazuje prítomnosť správneho peptidu.

Na ďalšie preskúmanie molekulovej identity sa často používa hmotnostná spektrometria.

Hmotnostná spektrometria, zvyčajne označovaná skratkou MS, je analytická technika, pri ktorej sa meria pomer hmotnosti a náboja ionizovaných molekúl. Pri analýze peptidov možno nameranú molekulovú hmotnosť porovnať s teoreticky očakávanou hmotnosťou aminokyselinovej sekvencie.

Keď sa tieto hodnoty zhodujú, podporuje to identifikáciu skúmaného peptidu. Ani hmotnostná spektrometria však neposkytuje samostatne úplný obraz o kvalite.

V tomto blogu sa zaoberáme tým, ako hmotnostná spektrometria funguje, prečo môžu peptidy vytvárať viacero hmotnostných signálov a ako sa výsledky MS interpretujú spolu s HPLC a ďalšími analytickými metódami.

---

Čo je hmotnostná spektrometria?

Hmotnostná spektrometria je analytická technika, pri ktorej sa molekuly premieňajú na nabité častice, teda ióny.

Tieto ióny sa následne separujú a merajú na základe ich pomeru hmotnosti a náboja.

Tento pomer sa vyjadruje ako:

m/z

Pritom platí:

• m pre hmotnosť;
• z pre elektrický náboj.

Hmotnostný spektrometer teda nie vždy meria priamo celú molekulovú hmotnosť. Prístroj meria pomer hmotnosti a náboja.

Pri väčších molekulách vrátane mnohých peptidov môže vzniknúť viacero nábojov. V dôsledku toho môže byť ten istý peptid viditeľný na rôznych miestach hmotnostného spektra.

---

Prečo sa hmotnostná spektrometria používa pri analýze peptidov?

Peptid pozostáva zo špecifického poradia aminokyselín.

Každá kombinácia aminokyselín má teoreticky vypočítateľnú molekulovú hmotnosť.

Hmotnostná spektrometria sa môže použiť na preskúmanie, či nameraná hmotnosť zodpovedá tejto teoretickej hodnote.

Analýza MS môže prispieť k:

• potvrdenie molekulovej identity;
• porovnanie s teoretickou molekulovou hmotnosťou;
• detekcia určitých chemických modifikácií;
• analýza produktov rozkladu;
• výskum variantov peptidu;
• porovnanie výrobných šarží.

Zodpovedajúca hmotnosť podporuje identitu peptidu.

Výsledok však treba vždy posudzovať v súvislosti s analytickou metódou a ďalšími údajmi o kvalite.

---

Aká je teoretická molekulová hmotnosť?

Teoretická molekulová hmotnosť sa vypočítava na základe:

• aminokyselinová sekvencia;
• počet aminokyselín;
• prípadné chemické modifikácie;
• molekulová forma;
• špecifické koncové skupiny.

Keď aminokyseliny vytvoria peptidový reťazec, vzniknú peptidové väzby.

Počas vzniku každej peptidovej väzby sa odštiepi molekula vody. Hmotnosť celého peptidu preto nie je jednoducho súčtom všetkých jednotlivých aminokyselín.

Hmotnosť môžu ovplyvniť aj modifikácie.

Príkladmi sú:

• amidácia;
• acetylácia;
• fosforylácia;
• oxidácia;
• pridanie reťazcov mastných kyselín;
• tvorba disulfidových mostíkov.

Teoretickú hmotnosť preto treba vypočítať pre presnú molekulovú štruktúru.

---

Čo znamená molekulová váha?

Pojmy molekulová hmotnosť a molekulová váha sa často používajú ako synonymá.

V laboratórnych správach sa táto hodnota zvyčajne uvádza v jednotkách:

• dalton, skrátene Da;
• kilodalton, skrátene kDa.

Jeden dalton približne zodpovedá hmotnosti jedného atómu vodíka.

Peptid s molekulovou hmotnosťou 3 000 Da má teda hmotnosť približne 3 kDa.

Molekulová hmotnosť peptidov sa môže výrazne líšiť v závislosti od:

• dĺžka reťazca;
• zloženie aminokyselín;
• chemické modifikácie.

---

Ako funguje hmotnostný spektrometer?

Hmotnostný spektrometer sa zvyčajne skladá z viacerých častí.

1. Zavedenie vzorky

Peptid sa najprv pripraví a zavedie do prístroja.

Príprava vzorky môže ovplyvniť:

• intenzita signálu;
• detegovateľnosť;
• tvorba iónov;
• signály pozadia.

2. Ionizácia

Molekuly sa elektricky nabijú.

Často používané techniky analýzy peptidov sú:

• elektrosprejová ionizácia;
• matricou podporovaná laserová desorpcia/ionizácia.

3. Hmotnostná analýza

Vzniknuté ióny sa oddeľujú na základe pomeru ich hmotnosti a náboja.

4. Detekcia

Detektor zaznamenáva ióny.

5. Spracovanie údajov

Namerané signály sa prevedú na hmotnostné spektrum.

Toto spektrum obsahuje píky zodpovedajúce detegovaným iónom.

---

Čo je elektrosprejová ionizácia?

Elektrosprejová ionizácia, skrátene ESI, je často používaná ionizačná technika na analýzu peptidov.

Počas ESI sa kvapalná vzorka vedie cez malý otvor, pričom sa aplikuje elektrické napätie.

Tým vznikajú elektricky nabité kvapôčky.

Keď sa rozpúšťadlo odparí, zostanú nabité molekuly.

Dôležitou vlastnosťou ESI je, že väčšie molekuly môžu získať viacero elektrických nábojov.

Peptid sa môže napríklad vyskytovať ako:

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

M označuje molekulovú hmotnosť peptidu.

Viacnásobné náboje vytvárajú pre tú istú molekulu rôzne signály m/z.

---

Prečo má jeden peptid viacero píkov?

Keď peptid prijme viacero protónov, vzniknú rôzne iónové formy.

Predstavme si, že peptid má molekulovú hmotnosť približne 3 000 Da.

Možné signály sú približne takéto:

• jeden kladný náboj: m/z približne 3 001;
• dva kladné náboje: m/z približne 1 501;
• tri kladné náboje: m/z približne 1 001.

Všetky tieto signály môžu patriť tomu istému peptidu.

Softvér môže toto rozdelenie nábojov použiť na výpočet pôvodnej molekulovej hmotnosti.

Tento proces sa nazýva dekonvolúcia.

---

Čo je dekonvoluované hmotnostné spektrum?

Hrubé meranie ESI môže obsahovať viacero píkov s rôznym nábojom.

To môže interpretáciu skomplikovať.

Pomocou dekonvolučného softvéru sa rôzne nabité formy prepočítajú na jednu odhadovanú molekulovú hmotnosť.

Dekonvoluované spektrum možno preto jednoduchšie porovnať s:

• teoretická hmotnosť;
• referenčný štandard;
• špecifikácií produktu.

Kvalita výpočtu závisí od:

• intenzita signálu;
• rozlíšenie;
• šum pozadia;
• nastavenia softvéru;
• prítomnosť prekrývajúcich sa zložiek.

---

Čo je MALDI?

Laserová desorpcia/ionizácia podporovaná matricou, skrátene MALDI, je ďalšia ionizačná technika.

Peptid sa zmieša s matricovým materiálom a nanesie na terčík.

Laser aktivuje matricu, čím vznikajú peptidové ióny.

MALDI často vytvára prevažne jednonásobne nabité ióny.

Vďaka tomu môže spektrum vyzerať jednoduchšie než spektrum ESI.

MALDI sa často kombinuje s analyzátorom hmotnosti s časom letu.

Táto kombinácia sa označuje ako:

MALDI-TOF

---

Čo je čas letu?

V analyzátore hmotnosti s časom letu sa ióny urýchľujú elektrickým poľom.

Potom prechádzajú meracou trubicou.

Ióny s nižším pomerom hmotnosti k náboju sa k detektoru zvyčajne dostanú rýchlejšie než ióny s vyšším pomerom.

Čas letu sa používa na výpočet hodnoty m/z.

Systémy TOF možno použiť na:

• identifikácia peptidov;
• stanovenie hmotnosti;
• porovnanie molekulových variantov.

Konečná presnosť závisí od kalibrácie, nastavení prístroja a prípravy vzorky.

---

Čo je LC-MS?

Kvapalinová chromatografia s hmotnostnou spektrometriou, skrátene LC-MS, kombinuje kvapalinovú chromatografiu s hmotnostnou spektrometriou.

Zložky sa najprv chromatograficky separujú.

Potom jednotlivé signály analyzuje hmotnostný spektrometer.

LC-MS môže kombinovať informácie o:

• retenčný čas;
• chromatografický profil;
• molekulová hmotnosť;
• možné nečistoty;
• produkty rozkladu.

Vďaka tomu môže LC-MS poskytnúť viac informácií než samostatná analýza HPLC alebo MS.

---

Aký je rozdiel medzi HPLC a hmotnostnou spektrometriou?

HPLC a hmotnostná spektrometria odpovedajú na odlišné analytické otázky.

HPLC

HPLC môže poskytnúť informácie o:

• chromatografickú čistotu;
• relatívne množstvo detegovaných zložiek;
• retenčné časy;
• zmeny v chromatografickom profile.

Hmotnostná spektrometria

Hmotnostná spektrometria môže poskytnúť informácie o:

• molekulová hmotnosť;
• možná identita;
• chemické modifikácie;
• určité produkty rozkladu.

Zjednodušené porovnanie:

Preto sa obe techniky často kombinujú.

---

Môže sa rovnaká molekulová hmotnosť vyskytovať pri rôznych peptidoch?

Áno.

Rôzne aminokyselinové sekvencie môžu mať rovnakú alebo takmer rovnakú celkovú hmotnosť.

Niekedy sa nazývajú izobárne štruktúry.

Zodpovedajúca hmotnosť preto nie vždy dokazuje, že celé poradie aminokyselín je správne.

Na podrobnejšiu identifikáciu môžu byť potrebné doplnkové techniky, ako napríklad:

• tandemová hmotnostná spektrometria;
• fragmentačná analýza;
• analýza aminokyselín;
• sekvenčná analýza;
• porovnanie s referenčným štandardom.

Potrebná analytická metóda závisí od požadovanej miery istoty.

---

Čo je tandemová hmotnostná spektrometria?

Tandemová hmotnostná spektrometria sa zvyčajne zapisuje ako:

MS/MS

Počas MS/MS sa vybraný peptidový ión ďalej fragmentuje.

Vzniknuté fragmenty sa následne znova zmerajú.

Fragmentačný vzor môže poskytnúť informácie o:

• poradie aminokyselín;
• umiestnenie modifikácií;
• identita peptidu;
• štruktúra produktov rozkladu.

MS/MS tak môže poskytnúť viac štruktúrnych informácií než len celkovú molekulovú hmotnosť.

---

Čo sú peptidové fragmenty?

Keď sa peptidový reťazec počas MS/MS rozštiepi na špecifických miestach, vznikajú fragmentové ióny.

Bežné typy fragmentov sú:

• b-ióny;
• y-ióny.

Hmotnosti týchto fragmentov možno použiť na rekonštrukciu častí aminokyselinovej sekvencie.

Interpretácia môže byť zložitá.

Nie každý peptid sa fragmentuje rovnakým spôsobom.

Medzi faktory, ktoré môžu mať vplyv, patria:

• zloženie aminokyselín;
• elektrický náboj;
• veľkosť peptidu;
• fragmentačná metóda;
• chemické modifikácie.

---

Môže hmotnostná spektrometria detegovať oxidáciu?

Určité oxidačné zmeny spôsobujú merateľnú zmenu hmotnosti.

Napríklad pridanie jedného atómu kyslíka často vedie k zvýšeniu hmotnosti približne o 16 Da.

Hmotnostná spektrometria tak môže pomôcť identifikovať určité oxidačné produkty.

Detekcia závisí od:

• koncentrácia;
• rozlíšenie prístroja;
• analytická metóda;
• separácia zložiek.

Nie každú oxidačnú zmenu možno úplne lokalizovať výlučne na základe jediného hmotnostného signálu.

Na to môže byť potrebná doplnková fragmentačná analýza.

---

Môže hmotnostná spektrometria určiť množstvo peptidu?

Nie automaticky.

Intenzitu hmotnostného signálu ovplyvňuje:

• účinnosť ionizácie;
• molekulové vlastnosti;
• rozpúšťadlo;
• nastavenia prístroja;
• prítomnosť iných zložiek.

Dvojnásobne silnejší signál preto automaticky neznamená, že je prítomné dvojnásobné množstvo peptidu.

Na spoľahlivú kvantifikáciu sú potrebné validované metódy a vhodné štandardy.

Možné techniky sú:

• kvantitatívna LC-MS;
• interné štandardy;
• izotopicky označené referencie;
• kalibrované HPLC testy.

---

Môže hmotnostná spektrometria preukázať sterilitu?

Nie.

Hmotnostná spektrometria na identifikáciu peptidu nie je testom sterility.

Výsledok neposkytuje priame informácie o:

• baktérie;
• plesne;
• mikrobiálny rast;
• sterilita výrobku.

Sterilita si vyžaduje špecifické mikrobiologické testovacie metódy.

Endotoxíny sa automaticky neurčujú ani pri štandardnej MS analýze peptidu.

---

Môže hmotnostná spektrometria merať endotoxíny?

Nie štandardnou analýzou identity.

Endotoxíny sú komplexné bakteriálne zložky.

Na analýzu endotoxínov sa používajú špecifické metódy, ako napríklad:

• test s lyzátom amebocytov Limulus;
• metódy rekombinantného faktora C.

Správne hmotnostné spektrum peptidu preto nedokazuje, že materiál má nízky obsah endotoxínov.

Identita, čistota, sterilita a endotoxíny sú samostatné parametre kvality.

---

Prečo sa môžu laboratórne výsledky líšiť?

Rôzne laboratóriá môžu uvádzať mierne odlišné hodnoty hmotnosti.

Možnými príčinami sú:

• typ prístroja;
• kalibrácia;
• ionizačná metóda;
• príprava vzorky;
• soľné addukty;
• použitý softvér;
• rozlíšenie;
• interpretačná metóda.

Malé rozdiely automaticky neznamenajú, že výsledok je nesprávny.

Nameraná hodnota sa musí posudzovať v rámci:

• presnosť prístroja;
• očakávaná molekulová forma;
• použitá analytická metóda.

---

Čo sú addukty?

Počas hmotnostnej spektrometrie sa peptidové ióny môžu spájať s inými nabitými časticami.

Príkladmi sú:

• sodík;
• draslík;
• amónny ión.

V dôsledku toho môžu vznikať ďalšie píky.

Napríklad sodný addukt má inú hmotnosť ako jednoducho protonovaný peptidový ión.

Addukty automaticky neznamenajú prítomnosť iného peptidu.

Interpretácia si vyžaduje znalosť:

• príprava vzorky;
• použité pufre;
• očakávané iónové formy.

---

Aké informácie patria do správy z MS?

Profesionálna analytická správa môže obsahovať napríklad:

• názov peptidu;
• číslo šarže alebo série;
• teoretická molekulová hmotnosť;
• nameraná molekulová hmotnosť;
• ionizačná metóda;
• typ hmotnostného spektrometra;
• hmotnostné spektrum;
• dátum analýzy;
• názov laboratória.

Pri podrobnejšej analýze možno uviesť aj:

• merací rozsah;
• rozlíšenie;
• hmotnostná presnosť;
• údaje o fragmentácii;
• použitý softvér.

Požadované vykazovanie závisí od cieľa výskumu.

---

Hmotnostná spektrometria a kontrola šarží

Každú výrobnú šaržu možno skúmať samostatne.

Analýza MS špecifická pre šaržu podporuje:

• kontrolu identity;
• porovnanie šarží;
• vysledovateľnosť;
• skúmanie odchýlok.

Číslo šarže v analytickej správe sa musí zhodovať s identifikáciou na liekovke.

Výsledok hmotnostnej spektrometrie bez jasného priradenia k šarži má obmedzenú hodnotu z hľadiska vysledovateľnosti.

---

Vedecké obmedzenia

Hmotnostná spektrometria je účinná analytická technika, ale nepredstavuje úplné hodnotenie kvality.

Zodpovedajúca molekulová hmotnosť automaticky nedokazuje:

• úplnú aminokyselinovú sekvenciu;
• vysokú chromatografickú čistotu;
• správne množstvo peptidu;
• sterilitu;
• nízky obsah endotoxínov;
• biologickú aktivitu;
• dlhodobú stabilitu.

Na širšie posúdenie môže byť potrebných viacero metód:

• HPLC;
• LC-MS;
• MS/MS;
• kvantitatívny test;
• štúdie stability;
• analýzu vlhkosti;
• dodatočné testy špecifické pre produkt.

Výsledky sa musia interpretovať spoločne.

---

Zhrnutie

Hmotnostná spektrometria sa používa na skúmanie molekulovej hmotnosti výskumných peptidov.

Táto technika meria pomer hmotnosti a náboja ionizovaných molekúl.

Pri analýze peptidov možno nameranú hmotnosť porovnať s teoreticky očakávanou hmotnosťou.

Zhoda podporuje molekulovú identifikáciu.

Dôležité analytické techniky sú:

• ESI-MS;
• MALDI-TOF;
• LC-MS;
• MS/MS.

Hmotnostná spektrometria však automaticky neposkytuje informácie o:

• presné množstvo;
• chromatografickú čistotu;
• sterilitu;
• endotoxíny;
• biologickú aktivitu.

Preto sa MS často kombinuje s HPLC a doplnkovými analýzami kvality.

---

Vyhlásenie o výskumnom použití

Výskumné peptidy Peptidera sa ponúkajú výlučne na účely výskumu (RUO) a sú určené na laboratórny výskum a analytické aplikácie.

Nie je určené na ľudskú ani zvieraciu konzumáciu, diagnostické použitie, terapeutické účely ani samopodávanie.

---

Kategória:
Znalosti o peptidoch a kontrola kvality

Súvisiace produkty Peptidera:
Lyofilizované výskumné peptidy s identifikáciou šarže a dostupnými analytickými údajmi o kvalite

Súvisiace interné blogy:

• PB-0227 — Lyofilizované peptidy a lyofilizácia
• PB-0228 — Peptidové liekovky a integrita balenia
• PB-0229 — Čísla šarží a vysledovateľnosť
• PB-0230 — Čistota peptidov a HPLC
• Čo je certifikát analýzy?

Návrhy interných odkazov:

• Odkaz na PB-0230 o rozdiele medzi HPLC a MS
• Odkaz na PB-0229 pri analýze špecifickej pre šaržu
• Odkaz na stránku s certifikátmi analýzy pri výsledkoch hmotnostnej spektrometrie
• Odkaz na kolekciu výskumných peptidov
• Odkaz na stránku o nezávislej laboratórnej analýze