Vysvetlenie štandardov referenčných peptidov
Peptidové referenčné štandardy: prečo je analytické porovnanie dôležité
Pri kvalitatívnej analýze výskumných peptidov sa často používajú techniky, ako napríklad:
- HPLC;
- LC-MS;
- stanovenie obsahu peptidu;
- analýza aminokyselín;
- UV spektrofotometria.
Tieto prístroje vytvárajú namerané údaje, no signál detektora ani chromatografický pík nemajú automaticky presný význam.
Na spoľahlivú identifikáciu alebo kvantifikáciu neznámej vzorky ju možno porovnať s materiálom, ktorého relevantné vlastnosti už boli dôkladne stanovené.
Takýto materiál sa nazýva referenčný štandard.
Dobre charakterizovaný peptidový referenčný štandard možno použiť na:
- identifikácia;
- porovnanie retenčných časov;
- kvantifikácia;
- kalibrácia;
- hodnotenie HPLC metód;
- skúmanie nečistôt;
- analýza degradačných produktov;
- podpora metrologickej nadväznosti.
Kvalita analytického výsledku preto nezávisí iba od laboratórneho prístroja. Dôležitá je aj identita, čistota, obsah peptidu, skladovanie a dokumentácia použitého referenčného štandardu.
Referenčný štandard navyše automaticky nie je to isté ako ľubovoľná vzorka s vysokým percentom podľa HPLC. Na kvantitatívne použitie musí byť jasné, koľko skutočného peptidu je prítomné a ktoré nepeptidové zložky prispievajú k celkovej hmotnosti.
V tomto článku si vysvetlíme, čo sú peptidové referenčné štandardy, ako sa líšia primárne a sekundárne štandardy a prečo je analytické porovnanie dôležité pre spoľahlivú analýzu peptidov.
Čo je peptidový referenčný štandard?
Peptidový referenčný štandard je starostlivo charakterizovaný materiál, ktorý sa používa ako porovnávací základ počas laboratórnej analýzy.
V závislosti od cieľa výskumu môžu byť stanovené vlastnosti, ako napríklad:
- aminokyselinová sekvencia;
- molekulová hmotnosť;
- identita;
- čistota podľa HPLC;
- obsah peptidu;
- obsah vody;
- obsah protiiónov;
- prítomnosť relevantných nečistôt;
- stabilita pri skladovaní.
Štandard sa následne môže použiť na analytické porovnanie neznámej vzorky.
Požadovaná charakterizácia závisí od použitia.
Štandard na identifikáciu nemusí vždy spĺňať presne rovnaké požiadavky ako štandard na kvantitatívne stanovenie.
Prečo je potrebné analytické porovnanie?
Laboratórny prístroj meria fyzikálny alebo chemický signál.
Príkladmi sú:
- UV absorpcia;
- fluorescencia;
- plocha chromatografického píku;
- pomer hmotnosti a náboja;
- intenzita iónov.
Signál sa automaticky nerovná presnému množstvu peptidu.
Na to je potrebný spoľahlivý vzťah medzi:
- známe množstvo;
- nameraný signál;
- neznáma vzorka.
Referenčný štandard môže pomôcť stanoviť tento vzťah.
Jednoduchý príklad
Predstavme si, že laboratórium chce pomocou kvantitatívnej HPLC stanoviť množstvo peptidu.
Laboratórium pripravuje rôzne roztoky charakterizovaného referenčného štandardu:
- 0,1 mg/ml;
- 0,25 mg/ml;
- 0,5 mg/ml;
- 0,75 mg/ml;
- 1,0 mg/ml.
Každý roztok sa analyzuje.
Namerané plochy píkov sa vynesú oproti známym koncentráciám.
Takto vznikne kalibračná krivka.
Následne sa zmeria neznáma vzorka.
Koncentráciu možno vypočítať porovnaním signálu vzorky s kalibračnou krivkou.
Spoľahlivosť tohto výpočtu závisí okrem iného od:
- kvalita referenčného štandardu;
- správny výpočet koncentrácie;
- presné váženie;
- presné pipetovanie;
- linearita metódy;
- stabilita roztokov.
Čo je primárny referenčný štandard?
Primárny referenčný štandard je materiál, ktorého relevantné vlastnosti boli podrobne stanovené.
Štandard možno charakterizovať pomocou viacerých nezávislých analytických techník.
Možné analýzy sú:
- HPLC;
- LC-MS;
- analýza aminokyselín;
- stanovenie obsahu vody;
- analýza protiiónov;
- NMR;
- elementárna analýza;
- hmotnostná bilancia.
Cieľom je s vysokou spoľahlivosťou stanoviť:
- aký materiál je prítomný;
- aká je jeho čistota;
- aké množstvo požadovanej zložky je prítomné;
- ktoré korekčné faktory sú potrebné.
Primárny štandard možno následne použiť na kvalifikáciu ďalších štandardov.
Čo je sekundárny referenčný štandard?
Sekundárny referenčný štandard sa tiež nazýva:
- pracovný štandard;
- pracovný štandard;
- interný referenčný štandard.
Tento štandard sa kvalifikuje porovnaním s primárnym alebo oficiálne uznaným referenčným štandardom.
Sekundárny štandard možno použiť na rutinné laboratórne analýzy.
Možné výhody sú:
- vyššia dostupnosť;
- nižšie náklady;
- zachovanie primárneho štandardu;
- efektívnejšie rutinné používanie.
Sekundárny štandard sa však musí pravidelne kontrolovať a správne skladovať.
Prečo sa primárny štandard nepoužíva vždy?
Primárne štandardy môžu:
- majú obmedzenú dostupnosť;
- sú nákladné;
- dodávajú sa v malých množstvách;
- môžu byť určené na špecifické oficiálne analytické metódy.
Kvalifikáciou sekundárneho štandardu voči primárnemu štandardu možno vykonávať rutinné skúšky bez neustáleho používania primárneho štandardu.
Spoľahlivosť závisí od kvality kvalifikácie.
Čo znamená kvalifikácia pracovného štandardu?
Kvalifikácia znamená, že vlastnosti pracovného štandardu sa systematicky skúmajú a porovnávajú s vhodným referenčným materiálom.
Kvalifikačný program môže pozostávať z:
- kontrola identity;
- čistota podľa HPLC;
- stanovenie obsahu peptidu;
- obsah vody;
- obsah protiiónov;
- porovnanie chromatogramov;
- porovnanie hmotnostných spektier;
- hodnotenie stability.
Potrebné skúšky závisia od zamýšľaného použitia.
Identita verzus kvantifikácia
Referenčný štandard môže mať rôzne analytické funkcie.
Identifikačný štandard
Identifikačný štandard sa používa na overenie, či sa neznáma vzorka zhoduje s očakávaným peptidom.
Možné porovnania sú:
- retenčný čas HPLC;
- molekulová hmotnosť;
- hmotnostnospektrometrický profil;
- spektroskopické vlastnosti.
Kvantitatívny štandard
Kvantitatívny štandard sa používa na stanovenie množstva peptidu.
Na tento účel musí byť skutočný obsah peptidu známy s dostatočnou spoľahlivosťou.
Samotná vysoká čistota stanovená HPLC na to zvyčajne nestačí.
Prečo čistota stanovená HPLC nie je dostatočná?
Peptid môže mať napríklad čistotu stanovenú HPLC na úrovni 99 %.
To však automaticky neznamená, že 99 % celkovej hmotnosti tvorí peptid.
Materiál môže okrem toho obsahovať:
- voda;
- acetát;
- chlorid;
- TFA;
- soli;
- inými komponentmi nemeranými chromatograficky.
Pri kvantitatívnom štandarde preto treba rozlišovať medzi:
- chromatografická čistota;
- celková hmotnosť materiálu;
- čistý obsah peptidu.
Čo je priradená hodnota?
Referenčný štandard môže mať priradenú hodnotu.
Táto hodnota opisuje napríklad:
- obsah peptidu;
- čistota;
- koncentrácia;
- účinnosť;
- množstvo v balení.
Priradená hodnota musí vychádzať z vhodných analytických údajov.
Možno uviesť aj korekčný faktor.
Čo je korekčný faktor?
Korekčný faktor sa používa na prepočet naváženého množstva materiálu na skutočné množstvo peptidu.
Predpokladajme:
- navážka materiálu: 10,0 mg;
- priradený obsah peptidu: 85 %;
- skutočné množstvo peptidu: 8,5 mg.
Ak sa táto korekcia neuplatní, vypočítaná koncentrácia môže byť nadhodnotená.
Prečo je čistý obsah peptidu dôležitý?
Čistý obsah peptidu opisuje podiel skutočného peptidu v skúmanom materiáli.
Pri výpočte možno zohľadniť faktory, ako sú:
- zvyšková vlhkosť;
- protiióny;
- organické zložky;
- anorganické zložky.
Pri kvantitatívnej analýze je to často relevantnejšie než samotná čistota stanovená HPLC.
Akú úlohu zohráva analýza aminokyselín?
Analýzu aminokyselín možno použiť na stanovenie obsahu peptidu.
Peptidový reťazec sa pritom hydrolyzuje na jednotlivé aminokyseliny.
Následne sa kvantifikujú vybrané aminokyseliny.
Keď je známe, koľko týchto aminokyselín sa nachádza v každom peptidovom reťazci, možno vypočítať množstvo peptidu.
Analýza aminokyselín tak môže prispieť k priradeniu hodnoty referenčnému štandardu.
Akú úlohu zohráva hmotnostná spektrometria?
Hmotnostná spektrometria môže pomôcť pri potvrdení:
- molekulová hmotnosť;
- identita;
- určité modifikácie;
- produkty degradácie.
LC-MS môže kombinovať chromatografickú separáciu s hmotnostnou detekciou.
Zodpovedajúca molekulová hmotnosť podporuje identitu, ale sama osebe nedokazuje:
- presné množstvo peptidu;
- úplná sekvencia;
- neprítomnosť všetkých nečistôt.
Preto sa často kombinuje viacero techník.
Akú úlohu zohráva MS/MS?
Pri tandemovej hmotnostnej spektrometrii sa vybraný peptidový ión fragmentuje.
Fragmenty môžu poskytnúť informácie o poradí aminokyselín.
MS/MS tak môže poskytnúť dodatočnú podporu pre:
- potvrdenie sekvencie;
- lokalizácia modifikácií;
- identifikácia degradačných produktov.
Analytická schopnosť závisí od:
- veľkosť peptidu;
- fragmentácia;
- rozlíšenie prístroja;
- spracovanie údajov.
Akú úlohu zohráva HPLC?
HPLC možno použiť na:
- porovnanie retenčných časov;
- hodnotenie chromatografickej čistoty;
- skúmanie vedľajších píkov;
- kvantitatívny test;
- štúdia stability.
Pri porovnávaní sa referencia a vzorka musia analyzovať rovnakou kontrolovanou metódou.
Dôležitými parametrami sú:
- typ kolóny;
- mobilná fáza;
- teplota;
- prietok;
- detekčná vlnová dĺžka.
Čo je kalibračná krivka?
Kalibračná krivka opisuje vzťah medzi známymi koncentráciami a nameranými signálmi detektora.
Spoľahlivá kalibračná krivka sa musí posúdiť z hľadiska:
- linearita;
- rozsah merania;
- reprodukovateľnosť;
- odchýlky;
- vhodnosť pre analytickú metódu.
Neznáma koncentrácia sa vypočíta v rámci validovaného rozsahu merania.
Extrapolácia mimo tohto rozsahu môže spôsobiť dodatočnú neistotu.
Čo je linearita?
Linearita opisuje, do akej miery sa meraný signál mení úmerne ku koncentrácii.
Keď sa koncentrácia zdvojnásobí, v rámci lineárneho rozsahu sa očakáva zodpovedajúca zmena signálu.
Tento vzťah nemusí byť pre každú metódu a v celom koncentračnom rozsahu lineárny.
Preto sa relevantný rozsah merania skúma experimentálne.
Čo znamená analytická nadväznosť?
Analytická alebo metrologická nadväznosť opisuje, ako je výsledok merania prostredníctvom zdokumentovaného reťazca porovnaní prepojený s uznávanou referenciou.
Dôležitými súčasťami sú:
- použitý štandard;
- certifikát;
- priradená hodnota;
- kalibrácia;
- analytická metóda;
- neistota merania;
- dokumentácia.
Nadväznosť podporuje porovnateľnosť výsledkov medzi:
- rôznych dňoch merania;
- laboratóriách;
- prístrojoch;
- šaržiach.
Čo je metrologická nadväznosť?
Metrológia je veda o meraní.
Metrologická nadväznosť vyžaduje zdokumentovaný a neprerušený reťazec porovnaní s určenou referenciou. Každý krok prispieva k celkovej neistote merania.
Praktická nadväznosť pri analýze peptidov môže okrem iného závisieť od:
- referenčný štandard;
- priradený obsah peptidu;
- kalibrované váhy;
- objemové zariadenia;
- analytická metóda.
Čo je neistota merania?
Každé analytické meranie obsahuje neistotu.
Možnými zdrojmi sú:
- neistota referenčného štandardu;
- váženie;
- pipetovanie;
- riedenie;
- variabilita prístroja;
- kalibrácia;
- integrácia píkov;
- príprava vzorky.
Neistota merania neznamená, že výsledok je nespoľahlivý.
Opisuje odhadované rozpätie, v ktorom sa skutočná hodnota môže odôvodnene nachádzať.
Prečo musia byť štandardy špecifické pre šaržu?
Aj referenčné štandardy sa vyrábajú v šaržiach.
Rôzne šarže sa môžu líšiť v:
- obsah peptidu;
- obsah vody;
- obsah protiiónov;
- profil čistoty;
- stabilita.
Preto musí byť jasné, ktoré číslo šarže referenčného štandardu sa použilo.
Čo je uvedené na certifikáte referenčného štandardu?
Certifikát môže obsahovať informácie o:
- názov;
- katalógové číslo;
- číslo šarže;
- priradená hodnota;
- zamýšľané použitie;
- podmienky skladovania;
- informácie o platnosti;
- analytické metódy;
- korekčný faktor.
Nie každý certifikát obsahuje rovnaké údaje.
Štandard sa musí používať podľa príslušných pokynov.
Prečo sú podmienky skladovania dôležité?
Referenčný štandard sa môže počas skladovania meniť.
Možné procesy sú:
- oxidáciu;
- deamidáciu;
- absorpciu vlhkosti;
- agregáciu;
- rozklad.
Preto možno stanoviť podmienky pre:
- teplota;
- ochrana pred svetlom;
- ochrana pred vlhkosťou;
- použitie po otvorení;
- doba skladovania.
Štandard, ktorý bol nesprávne skladovaný, môže viesť k nesprávnym porovnaniam.
Čo je dátum exspirácie?
Niektoré referenčné štandardy majú stanovený dátum exspirácie.
Iné štandardy používajú:
- kontrola platnosti;
- dátum rekvalifikácie;
- aktuálny stav šarže.
Laboratórium musí overiť, či je štandard v čase použitia vhodný a platný.
Čo je rekvalifikácia?
Rekvalifikácia je opätovné posúdenie referenčného štandardu.
Možné analýzy sú:
- HPLC;
- LC-MS;
- stanovenie obsahu peptidu;
- obsah vody;
- porovnaní s primárnym štandardom.
Rekvalifikácia môže byť potrebná po:
- vopred stanovená doba použiteľnosti;
- dlhodobé skladovanie;
- zmena vzhľadu;
- odchylný výsledok analýzy.
Prečo sú štandardy nečistôt dôležité?
Ako štandard možno použiť nielen požadovaný peptid.
Ako referenčný materiál môžu slúžiť aj známe nečistoty alebo degradačné produkty.
Príkladmi sú:
- oxidačné produkty;
- deamidované varianty;
- fragmenty;
- delečné sekvencie;
- komponenty súvisiace s agregáciou.
Tieto štandardy môžu pomôcť identifikovať a kvantifikovať vedľajšie píky.
Čo sú degradačné štandardy?
Degradačný štandard predstavuje známy produkt rozkladu.
Možno ho použiť na preskúmanie:
- kde degradačný produkt eluoval;
- aká molekulová hmotnosť je prítomná;
- aká citlivá je analytická metóda;
- koľko degradačného produktu je prítomného.
Nie každý degradačný produkt je dostupný ako čistý štandard.
Referenčné štandardy a validácia metódy
Analytická metóda musí byť preukázateľne vhodná na zamýšľaný účel.
ICH Q2(R2) opisuje zásady validácie analytických postupov. Medzi relevantné charakteristiky môžu patriť špecificita, správnosť, presnosť, linearita a merací rozsah.
Referenčné štandardy možno použiť pri skúmaní:
- správnosť;
- špecificita;
- linearita;
- kvantitatívny rozsah;
- výkonnosť metódy.
Čo je správnosť?
Správnosť opisuje, ako blízko je nameraný výsledok k akceptovanej referenčnej hodnote.
Dobre charakterizovaný štandard možno použiť na preskúmanie správnosti analytickej metódy.
Čo je presnosť?
Presnosť opisuje, ako blízko sú opakované výsledky merania pri sebe.
Metóda môže poskytovať veľmi presné výsledky, ktoré sa však systematicky odchyľujú.
Preto sú dôležité presnosť aj správnosť.
Čo je špecificita?
Špecificita opisuje, či analytická metóda dokáže dostatočne rozlíšiť požadovanú zložku od ostatných zložiek.
Príkladmi sú:
- nečistoty;
- produkty degradácie;
- zložky formulácie;
- protiióny.
Vhodný referenčný štandard môže pomôcť pri identifikácii hlavného píku.
Môžu dve laboratóriá získať odlišné výsledky?
Áno.
Rozdiely môžu vzniknúť v dôsledku:
- referenčný štandard;
- analytická metóda;
- príprava vzorky;
- zariadenia;
- kalibrácia;
- spracovanie údajov;
- neistota merania.
Používanie dobre charakterizovaných štandardov a validovaných metód môže zlepšiť porovnateľnosť.
Je komerčný peptid automaticky referenčným štandardom?
Nie.
Komerčný peptid môže byť vhodný ako výskumný materiál, ale automaticky nie je kvalifikovaným referenčným štandardom.
Na použitie ako štandard musí byť jasné:
- identita;
- obsah peptidu;
- čistota;
- obsah vody;
- obsah protiiónov;
- stabilita pri skladovaní;
- dokumentácia.
Požiadavky závisia od analytického účelu.
Oficiálne liekopisné referenčné štandardy
Oficiálne organizácie poskytujú referenčné štandardy pre špecifické kompendiálne aplikácie.
Príkladmi sú:
- Referenčné štandardy USP;
- Referenčné štandardy Európskeho liekopisu;
- Medzinárodné chemické referenčné látky WHO.
Tieto štandardy sú určené na aplikácie opísané v príslušných oficiálnych metódach alebo dokumentácii.
Nie pre každý výskumný peptid existuje oficiálny liekopisný štandard.
Vedecké obmedzenia
Referenčný štandard zlepšuje analytickú porovnateľnosť, ale nevyrieši každú výzvu pri meraní.
Spoľahlivosť naďalej závisí od:
- analytická metóda;
- príprava vzorky;
- prístroj;
- kalibrácia;
- skladovanie;
- spracovanie údajov;
- neistota merania.
Zodpovedajúci retenčný čas podľa HPLC sám osebe nedokazuje úplnú molekulovú identitu.
Zodpovedajúca molekulová hmotnosť automaticky nedokazuje:
- správna úplná sekvencia;
- presné množstvo peptidu;
- neprítomnosť všetkých nečistôt.
Preto sa používajú viaceré doplnkové analytické techniky.
Zhrnutie
Referenčný štandard peptidu je dobre charakterizovaný materiál používaný ako analytický porovnávací základ.
Referenčné štandardy možno použiť na:
- identifikácia;
- porovnanie pomocou HPLC;
- kalibrácia;
- stanovenie obsahu peptidu;
- kvantifikácia;
- validácia metódy;
- analýza nečistôt.
Primárny štandard sa podrobne charakterizuje.
Sekundárny alebo pracovný štandard sa kvalifikuje voči vhodnému primárnemu referenčnému štandardu a možno ho použiť na rutinnú analýzu.
Pri kvantitatívnych aplikáciách samotná čistota podľa HPLC zvyčajne nepostačuje. Treba posúdiť aj obsah peptidu, vodu, protiióny a ďalšie relevantné zložky.
Spoľahlivé analytické porovnanie si vyžaduje:
- vhodný referenčný štandard;
- správne priradenie hodnoty;
- sledovateľnosť šarže;
- kontrolované skladovanie;
- validovaná analytická metóda;
- hodnotenie neistoty merania.
Oficiálne zdroje a vedecké referencie
-
ICH Q2(R2) — Validation of Analytical Procedures
Medzinárodné usmernenie na validáciu analytických postupov vrátane špecificity, správnosti, precíznosti, linearity a rozsahu merania. -
USP — Official Reference Standards
USP opisuje referenčné štandardy ako komplexne charakterizované materiály určené okrem iného na skúmanie identity, sily, čistoty a kvality. -
European Pharmacopoeia Reference Standards — EDQM
Katalóg EDQM obsahuje oficiálne platné referenčné štandardy pre použitia opísané v Európskom liekopise. -
WHO — International Chemical Reference Substances
WHO-ICRS sa stanovujú postupmi, ktoré sú v súlade s usmerneniami WHO pre chemické referenčné látky. -
NIST — Metrological Traceability
NIST opisuje metrologickú sledovateľnosť ako zdokumentovaný, neprerušený reťazec kalibrácií k špecifikovaným referenciám. -
NIST — Standard Reference Materials
NIST vyvíja a certifikuje referenčné materiály s dobre charakterizovaným zložením alebo vlastnosťami na podporu spoľahlivých a porovnateľných meraní. -
FDA — Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics
Usmernenia FDA sa zaoberajú používaním a kvalifikáciou referenčných štandardov v rámci validácie analytických metód.
Vylúčenie zodpovednosti pre výskumné použitie
Výskumné peptidy Peptidera sú ponúkané výhradne na účely Research Use Only (RUO) a sú určené na laboratórny výskum a analytické použitie.
Nie je určené na konzumáciu ľuďmi ani zvieratami, diagnostické použitie, terapeutické použitie ani samostatné podávanie.
Kategória:
Znalosti o peptidoch a kontrola kvality
Súvisiace produkty Peptidera:
Výskumné peptidy s identifikáciou šarže a dostupnými nezávislými analytickými údajmi o kvalite
Súvisiace interné blogy:
- PB-0230 — Čistota peptidov a HPLC
- PB-0231 — Hmotnostná spektrometria pri peptidoch
- PB-0233 — Peptidový test: čistota verzus obsah peptidu
- PB-0238 — Protiióny v peptidoch
- PB-0239 — Analýza aminokyselín v peptidoch
- PB-0241 — Reťazec dohľadu pri analýze peptidov
Návrhy interných odkazov:
- Odkaz na PB-0230 o retenčnom čase HPLC a chromatografickom porovnaní
- Odkaz na PB-0231 o LC-MS, molekulovej hmotnosti a MS/MS
- Odkaz na PB-0233 o kvantitatívnych peptidových testoch
- Odkaz na PB-0238 o protiiónoch a čistom obsahu peptidu
- Odkaz na PB-0239 o analýze aminokyselín a priradení hodnoty
- Odkaz na PB-0241 o sledovateľnosti štandardov a vzoriek
- Odkaz na stránku Peptidera s nezávislými analytickými certifikátmi
- Odkaz na kolekciu výskumných peptidov