Čistota peptidu: čo znamená 99 % HPLC?
Vysvetlenie čistoty peptidu: čo skutočne znamená percento HPLC?
Pri výskumných peptidoch sa často uvádza percentuálna čistota. Hodnoty ako 98 %, 99 % alebo 99,5 % čistota sa pravidelne používajú na opis kvality peptidu.
Vysoké percento sa zdá byť jednoduché na interpretáciu: čím vyššie číslo, tým lepší produkt. V praxi je čistota peptidu zložitejšia.
Výsledok HPLC poskytuje informácie o relatívnom zložení analyzovanej vzorky. Percento však automaticky nedokazuje:
- že je prítomný správny peptid;
- že aminokyselinová sekvencia je úplne správna;
- že uvedené množstvo peptidu v injekčnej liekovke je správne;
- že materiál je sterilný;
- že neobsahuje endotoxíny;
- že boli zmerané všetky možné nečistoty.
Na dôkladné posúdenie kvality peptidu je potrebné posudzovať viacero analytických údajov spoločne.
V tomto blogu sa venujeme tomu, ako sa meria čistota peptidu, čo znamená percento HPLC a prečo je čistota iba jednou súčasťou komplexnej kontroly kvality.
Čo znamená čistota peptidu?
Čistota peptidu opisuje, aká časť detegovaných zložiek súvisiacich s peptidom zodpovedá hlavnej zložke v analyzovanej vzorke.
Keď certifikát analýzy napríklad uvádza HPLC čistotu 99% ak sa uvádza, zvyčajne to znamená, že približne 99 % integrovaného chromatografického signálu bolo priradených hlavnému píku.
To však automaticky neznamená, že 99 % celkovej hmotnosti v injekčnej liekovke tvorí požadovaný peptid.
Injekčná liekovka môže okrem peptidu obsahovať aj ďalšie zložky, napríklad:
- voda;
- protiióny;
- soli;
- pomocné látky;
- zvyškové produkty z výroby;
- nedetekovateľné zložky.
Percento HPLC a skutočné množstvo peptidu sú preto odlišné parametre kvality.
Čo je HPLC?
HPLC je skratka pre vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu.
Ide o analytickú techniku, pomocou ktorej možno oddeliť rôzne chemické zložky vo vzorke.
Počas analýzy HPLC sa rozpustená vzorka vedie cez kolónu. Táto kolóna obsahuje stacionárnu fázu.
Kvapalina, ktorá preteká kolónou, sa nazýva mobilná fáza.
Rôzne molekuly nereagujú s týmito fázami rovnakým spôsobom. Preto sa niektoré zložky pohybujú kolónou rýchlejšie než iné.
Výsledok sa zobrazuje v chromatograme.
Chromatogram zvyčajne pozostáva z:
- horizontálna časová os;
- vertikálna signálová os;
- jeden alebo viac píkov.
Každý pík predstavuje detegovaný komponent alebo skupinu komponentov.
Čo je retenčný čas?
Čas, ktorý komponent potrebuje na prechod kolónou HPLC a dosiahnutie detektora, sa nazýva retenčný čas.
Retenčný čas môže byť ovplyvnený:
- typ kolóny HPLC;
- zloženie mobilnej fázy;
- teplota;
- prietoková rýchlosť;
- vlastnosti peptidu;
- použitá analytická metóda.
Zodpovedajúci retenčný čas môže pomôcť pri porovnaní s referenčným štandardom.
Samotný retenčný čas však zvyčajne nestačí na definitívne potvrdenie identity peptidu.
Rôzne molekuly môžu mať za určitých podmienok podobné retenčné časy.
Preto sa HPLC často kombinuje s hmotnostnou spektrometriou.
Ako sa vypočítava percento čistoty?
Pri mnohých analýzach HPLC sa vypočítava plocha pod každým chromatografickým píkom.
Toto sa nazýva integrácia plochy píkov.
Zjednodušený príklad:
- hlavný pík: 99 %;
- vedľajší pík A: 0,5 %;
- vedľajší pík B: 0,3 %;
- ostatné detegované píky: 0,2 %.
Uvedená chromatografická čistota je potom približne 99 %.
Tento výpočet závisí od:
- metóda detekcie;
- nastavenia integrácie;
- zvolená vlnová dĺžka;
- analytická metóda;
- detekčný limit;
- koncentrácia vzorky.
Percento čistoty sa preto musí vždy interpretovať v kontexte použitej metódy.
Čo znamená hlavný pík?
Najväčší pík v chromatograme sa často nazýva hlavný pík.
Pri dobre charakterizovanom peptide sa očakáva, že tento pík zodpovedá požadovanému peptidu.
To však musí byť analyticky potvrdené.
Veľký pík sám osebe nedokazuje prítomnosť správnej molekulovej štruktúry.
Na podporu identifikácie možno použiť doplnkové techniky, ako napríklad:
- hmotnostná spektrometria;
- analýza aminokyselín;
- sekvenčná analýza;
- jadrová magnetická rezonancia;
- porovnanie s referenčným štandardom.
HPLC opisuje predovšetkým chromatografické zloženie vzorky.
Aké nečistoty môžu vzniknúť počas syntézy peptidov?
Mnohé syntetické peptidy sa vyrábajú pomocou syntézy peptidov na pevnej fáze, zvyčajne označovanej skratkou SPPS.
Počas tohto procesu sa aminokyseliny postupne pripájajú k rastúcemu peptidovému reťazcu.
V každom kroku môžu vzniknúť malé odchýlky v procese.
Možné nečistoty súvisiace s peptidmi sú:
Skrátené peptidové reťazce
Ak sa aminokyselina nepripojí správne, môže vzniknúť neúplný peptidový reťazec.
Tento produkt sa tiež nazýva skrátený produkt.
Sekvencie delécie
Pri deléčnej sekvencii chýba v zamýšľanom reťazci jedna alebo viac aminokyselín.
Molekulová hmotnosť sa preto líši od hmotnosti požadovaného peptidu.
Chemicky modifikované varianty
Počas výroby, čistenia alebo skladovania môžu nastať chemické zmeny.
Príkladmi sú:
- oxidáciou;
- deamidáciou;
- hydrolýzou;
- izomerizácia.
Zvyšky ochranných skupín
Počas syntézy peptidov sa používajú dočasné ochranné skupiny, aby sa zabránilo nežiaducim reakciám.
Tie sa musia neskôr odstrániť.
Neúplné odstránenie môže prispieť k vzniku vedľajších zložiek.
Agregáty
Molekuly peptidov môžu za určitých podmienok vytvárať väčšie štruktúry.
Nie každá metóda HPLC deteguje alebo charakterizuje agregáciu rovnakým spôsobom.
Je 99 % čistota podľa HPLC to isté ako 99 % obsah peptidu?
Nie.
Ide o dôležité rozlíšenie.
Čistota podľa HPLC zvyčajne opisuje relatívny pomer detegovaných chromatografických zložiek.
Obsah peptidu opisuje množstvo skutočne prítomného peptidu v pomere k celkovému materiálu.
Napríklad lyofilizovaná liekovka môže obsahovať:
- požadovaný peptid;
- voda;
- protiióny;
- soli;
- pomocné látky.
Tieto zložky sa pri štandardnej analýze HPLC nemerajú nevyhnutne všetky rovnakým spôsobom.
Preto môže mať vzorka vysokú chromatografickú čistotu, zatiaľ čo celkový obsah peptidu je nižší než percentuálny podiel stanovený pomocou HPLC.
Na kvantitatívne stanovenie sú potrebné doplnkové analytické metódy.
Čo je peptidový test?
Test sa používa na stanovenie množstva alebo koncentrácie konkrétnej zložky.
V závislosti od cieľa výskumu možno použiť rôzne metódy.
Príkladmi sú:
- kvantitatívna HPLC s referenčným štandardom;
- analýza aminokyselín;
- analýza dusíka;
- spektroskopické techniky;
- výpočty hmotnostnej bilancie.
Test odpovedá na inú otázku než štandardná analýza čistoty.
Analýza čistoty vyžaduje:
Aká časť detegovaných peptidových zložiek patrí k hlavnému píku?
Kvantitatívny test vyžaduje:
Aké množstvo požadovaného peptidu je skutočne prítomné?
Oba údaje môžu byť relevantné pre úplnú charakterizáciu kvality.
Prečo je hmotnostná spektrometria dôležitá?
Hmotnostná spektrometria, často označovaná skratkou MS, meria pomer hmotnosti a náboja ionizovaných molekúl.
Pri analýze peptidov možno skúmať, či nameraná molekulová hmotnosť zodpovedá teoreticky očakávanej hmotnosti.
Hmotnostná spektrometria môže prispieť k:
- potvrdenie identity;
- detekcia konkrétnych modifikácií;
- analýza degradačných produktov;
- porovnanie peptidových variantov.
Keď nameraná hmotnosť zodpovedá očakávanej hmotnosti, podporuje to identifikáciu.
Hmotnostná spektrometria však neposkytuje automaticky úplné informácie o:
- percentuálna čistota;
- presné množstvo;
- sterilita;
- endotoxíny;
- biologická aktivita.
Preto sa HPLC a hmotnostná spektrometria navzájom dopĺňajú.
Čo je LC-MS?
LC-MS kombinuje kvapalinovú chromatografiu s hmotnostnou spektrometriou.
Najprv sa komponenty chromatograficky oddelia. Potom sa jednotlivé signály ďalej skúmajú hmotnostnou spektrometriou.
Táto kombinácia môže poskytnúť informácie o:
- retenčný čas;
- molekulová hmotnosť;
- možné nečistoty;
- produkty degradácie;
- chemické modifikácie.
LC-MS tak môže poskytnúť viac analytických informácií než jedna samostatná technika.
Kvalita výsledkov naďalej závisí od:
- príprava vzorky;
- nastavenia prístroja;
- validácia metódy;
- referenčné materiály;
- odborná interpretácia.
Prečo môžu rôzne laboratóriá namerať odlišné výsledky?
Ten istý peptid môže v rôznych laboratóriách poskytovať mierne odlišné výsledky.
Možnými príčinami sú:
- rôzne kolóny HPLC;
- iné mobilné fázy;
- odlišné gradienty;
- iné detekčné vlnové dĺžky;
- rozdiely v príprave vzorky;
- iné nastavenia integrácie;
- variabilita prístroja.
Rozdiel automaticky neznamená, že jedna z analýz je nesprávna.
Na správne porovnanie výsledkov treba zohľadniť aj analytickú metódu.
Percento bez informácií o metóde poskytuje iba obmedzený kontext.
Čo je validácia metódy?
Analytická metóda musí byť preukázateľne vhodná na zamýšľaný účel.
Toto sa nazýva validácia metódy.
Možné validačné charakteristiky sú:
- špecificita;
- presnosť;
- precíznosť;
- linearita;
- merací rozsah;
- detekčný limit;
- limit kvantifikácie;
- robustnosť.
Metóda na identifikačné skúmanie nemusí byť automaticky vhodná na presnú kvantifikáciu.
Preto musí byť vopred jasné, aká analytická otázka sa skúma.
Čo je detekčný limit?
Každá analytická metóda má hranicu, pod ktorou nemožno komponent spoľahlivo detegovať.
Toto sa nazýva limit detekcie.
Komponent, ktorý nie je v chromatograme viditeľný, preto automaticky neznamená, že úplne chýba.
Koncentrácia môže byť nižšia ako detekčný limit.
Okrem toho môžu niektoré látky:
- nereagovať s použitým detektorom;
- mimo meracieho rozsahu;
- počas prípravy vzorky stratené;
- nedostatočne oddelené.
Výrok „nezistené“ preto nie je vždy to isté ako „neprítomné“.
Dá sa chromatogram manipulovať?
Chromatogram musí obsahovať dostatok informácií na odborné posúdenie.
Dôležité údaje sú:
- názov produktu;
- číslo šarže;
- dátum analýzy;
- použitá metóda;
- nastavenia detektora;
- retenčné časy;
- integrácia píkov;
- laboratórne údaje.
Iba obrázok s jedným veľkým píkom a percentuálnym údajom poskytuje obmedzenú overiteľnosť.
Aj nastavenia integrácie môžu ovplyvniť, ktoré signály sa zahrnú do výpočtu.
Transparentné vykazovanie je preto dôležité.
Aké informácie má obsahovať spoľahlivý COA?
Certifikát analýzy môže okrem iného obsahovať:
- názov peptidu;
- aminokyselinová sekvencia;
- číslo šarže alebo lotu;
- dátum výroby;
- dátum testovania;
- výsledok HPLC;
- chromatogram;
- výsledok hmotnostnej spektrometrie;
- teoretická molekulová hmotnosť;
- nameraná molekulová hmotnosť;
- použité analytické metódy;
- názov laboratória.
Nie každý COA obsahuje všetky položky.
Potrebné informácie závisia od produktu a účelu výskumu.
Rozšírený COA môže poskytnúť väčšiu transparentnosť, no spoľahlivosť závisí aj od kvality analýzy.
Je vysoká čistota vždy nevyhnutná?
Požadovaná čistota závisí od účelu výskumu.
Pri niektorých analytických aplikáciách môžu mať veľmi malé množstvá vedľajších zložiek vplyv na:
- výsledky meraní;
- výskum receptorov;
- bunkový výskum;
- reprodukovateľnosť.
V takom prípade môže byť žiaduca vyššia úroveň čistoty.
Vyššie percento však automaticky neznamená, že všetky ostatné kvalitatívne charakteristiky sú lepšie.
Napríklad peptid s čistotou 99,5 % podľa HPLC môže stále:
- obsahovať odlišné množstvo;
- byť nesprávne skladovaný;
- byť nedostatočne identifikovaný;
- obsahovať zvýšené zvyškové množstvo vlhkosti;
- mať poškodený obal.
Kvalita sa preto musí posudzovať multidimenzionálne.
Čistota a rozdiely medzi šaržami
Každá výrobná šarža má vlastný výrobný a analytický proces.
Preto sa výsledky čistoty medzi šaržami môžu líšiť.
Analýza jednej šarže sa nesmie automaticky používať ako dôkaz pre všetky budúce šarže.
Analýza špecifická pre šaržu podporuje:
- sledovateľnosť;
- porovnanie;
- kontrola kvality;
- vyšetrovanie odchýlok.
Číslo šarže na liekovke sa preto musí zhodovať s číslom uvedeným na certifikáte analýzy.
Čistota a stabilita
Vysoká počiatočná čistota nezaručuje, že sa zachová počas dlhodobého skladovania.
Možné degradačné procesy sú:
- oxidáciou;
- hydrolýzou;
- deamidáciou;
- agregáciou.
Rýchlosť je ovplyvnená:
- teplota;
- vlhkosť;
- svetlo;
- kyslík;
- sekvencia aminokyselín;
- obal.
Štúdiu stability možno použiť na sledovanie zmien chromatografického profilu v priebehu času.
Vedecké obmedzenia
Žiadna analytická metóda sama osebe neposkytuje úplný obraz o kvalite peptidu.
HPLC môže poskytnúť dôležité informácie o chromatografickej čistote, ale má svoje obmedzenia.
Percentuálny údaj z HPLC automaticky nedokazuje:
- identita;
- presné množstvo peptidu;
- sekvencia aminokyselín;
- sterilita;
- obsah endotoxínov;
- biologická aktivita;
- dlhodobá stabilita.
Preto sa kombinuje viacero analytických metód.
Úplné posúdenie kvality môže zahŕňať:
- HPLC;
- hmotnostná spektrometria;
- kvantitatívny test;
- analýza vlhkosti;
- štúdia stability;
- ďalšie testy špecifické pre daný produkt.
Zhrnutie
Čistota peptidu je dôležitým parametrom kvality, ale percentuálny údaj z HPLC sa musí správne interpretovať.
Hodnota 99 % zvyčajne znamená, že približne 99 % integrovaného chromatografického signálu bolo priradených hlavnému píku.
Neznamená to automaticky, že:
- 99 % hmotnosti ampulky tvorí peptid;
- identita je úplne potvrdená;
- uvedené množstvo je správne;
- materiál je sterilný;
- vylúčené všetky možné nečistoty.
Na širšie posúdenie kvality je potrebné skombinovať výsledky HPLC s ďalšími údajmi, ako sú:
- hmotnostná spektrometria;
- informácie o šarži;
- kvantitatívna analýza;
- údaje o skladovaní;
- štúdia stability.
Kvalita peptidu preto pozostáva z viac než jedného percentuálneho údaja.
Vylúčenie zodpovednosti týkajúce sa výskumu
Výskumné peptidy Peptidera sa ponúkajú výhradne na výskumné použitie (RUO) a sú určené na laboratórny výskum a analytické aplikácie.
Nie je určené na konzumáciu ľuďmi ani zvieratami, diagnostické použitie, terapeutické účely ani samopodávanie.
Kategória:
Znalosti o peptidoch & kontrola kvality
Súvisiace produkty Peptidera:
Lyofilizované výskumné peptidy s identifikáciou šarže a dostupnými analytickými údajmi o kvalite
Súvisiace interné blogy:
- PB-0227 — Lyofilizované peptidy a lyofilizácia
- PB-0228 — Ampulky s peptidmi a integrita obalu
- PB-0229 — Čísla šarží a sledovateľnosť
- Čo je certifikát analýzy?
- Ako sa analyticky testujú výskumné peptidy?
Návrhy interných odkazov:
- Odkaz na PB-0229 týkajúci sa analýzy špecifickej pre šaržu
- Odkaz na stránku s certifikátmi analýzy (COA)
- Odkaz na PB-0227 týkajúci sa stability a degradácie
- Odkaz na kolekciu výskumných peptidov
- Odkaz na stránku o nezávislých laboratórnych testoch
Názov obrazového súboru:PB-0230-peptidezuiverheid-hplc-analyse.jpg