Ióny pri peptidoch: acetát, chlorid a TFA
Pri syntetických výskumných peptidoch sa často hovorí o čistote, molekulovej hmotnosti a obsahu peptidu. Menej viditeľné, ale analyticky dôležité sú protiióny.
Peptidy môžu byť počas syntézy a purifikácie prítomné vo forme soli. Kladne alebo záporne nabité skupiny na peptide pritom nesú ión s opačným nábojom. Tieto ióny sa nazývajú protiióny.
Bežné protiióny v peptidoch sú:
- acetát;
- chlorid;
- trifluóracetát, skrátene TFA.
Protiióny môžu ovplyvniť:
- celková hmotnosť;
- čistý obsah peptidu;
- rozpustnosť;
- pH roztokov;
- analytická interpretácia;
- porovnanie šarží.
HPLC čistota 99 % zvyčajne priamo nehovorí nič o množstve protiiónov. Preto treba protiióny chápať samostatne a v relevantných prípadoch ich samostatne analyzovať.
Čo je protiión?
Protiión je ión, ktorý kompenzuje elektrický náboj molekuly.
Peptidy často obsahujú nabité skupiny, napríklad:
- aminoskupiny;
- karboxylové skupiny;
- bočné reťazce nabitých aminokyselín.
Keď je peptid celkovo kladne nabitý, môže byť prítomný záporne nabitý protiión.
Keď je peptid celkovo záporne nabitý, môže byť prítomný kladne nabitý protiión.
Pri mnohých peptidových soliach ide najmä o záporné protiióny spojené s kladne nabitými skupinami.
Prečo majú peptidy protiióny?
Protiióny často vznikajú v dôsledku použitých výrobných a purifikačných metód.
Počas výroby peptidov sa môžu používať kyseliny, pufre a iónové činidlá.
Príkladmi sú:
- kyselina trifluóroctová počas RP-HPLC;
- kyselina octová pre acetátovú formu;
- kyselina chlorovodíková pre chloridovú formu.
Po purifikácii a lyofilizácii môžu tieto ióny čiastočne zostať v konečnom materiáli.
To automaticky neznamená, že výrobok je nekvalitný. Znamená to, že peptid je prítomný v určitej forme soli.
Acetát ako protiión
Acetát je ión kyseliny octovej.
Peptidy vo forme acetátu sa často používajú, keď je žiaduca nižšia záťaž TFA.
Acetát môže byť relevantný pre:
- forma soli;
- vlastnosti pH;
- analytická hmotnostná bilancia;
- obsah peptidu.
Acetát prispieva k celkovej suchej hmotnosti, ale nie je peptidovou reťazcom.
Preto môže byť čistý obsah peptidu nižší než celková hmotnosť liekovky.
Chlorid ako protiión
Chlorid je záporný ión kyseliny chlorovodíkovej.
Niektoré peptidy sa dodávajú ako hydrochloridová soľ.
Chlorid môže ovplyvniť:
- iónová sila;
- správanie pri rozpúšťaní;
- pH;
- celková hmotnosť.
Aj chlorid sa započítava do celkovej hmotnosti, nie však do čistej peptidovej reťazce.
TFA ako protiión
TFA označuje trifluóracetát.
TFA sa široko používa v peptidovej chémii a RP-HPLC, pretože môže poskytovať dobré chromatografické vlastnosti.
Môže pomôcť pri:
- tvar píku;
- separáciu;
- iónové párovanie;
- čistenie.
TFA však môže zostať v konečnom materiáli aj ako protiión.
Preto sa pri niektorých aplikáciách volí iónová výmena za acetát alebo chlorid.
Prečo je TFA analyticky dôležitá?
TFA môže mať významný podiel na celkovej hmotnosti.
Ak má peptid viacero kladne nabitých miest, môže byť prítomných viacero iónov TFA.
Môže to ovplyvniť:
- čistý obsah peptidu;
- hmotnostná bilancia;
- výpočty koncentrácie;
- interpretáciu obsahu liekovky.
Peptid teda môže mať veľmi vysokú čistotu podľa HPLC a napriek tomu obsahovať značný podiel protiiónov.
Protiióny a čistota podľa HPLC
Čistota podľa HPLC zvyčajne opisuje relatívnu plochu hlavného chromatografického píku.
Protiióny nie sú v štandardnej peptidovej metóde HPLC vždy viditeľné rovnakým spôsobom.
Preto:
99 % čistota podľa HPLC
automaticky neznamená:
99 % čistý obsah peptidu
Pri kvantitatívnom hodnotení treba protiióny zohľadniť samostatne.
Protiióny a stanovenie obsahu peptidu
Pri stanovení obsahu peptidu sa určuje skutočné množstvo peptidu.
Protiióny môžu byť dôležité, pretože prispievajú k celkovej hmotnosti.
Správne stanovenie obsahu môže rozlíšiť:
- brutto hmotnosť lyofilizovaného materiálu;
- čisté množstvo peptidu;
- obsah vody;
- obsah protiiónov;
- ostatné zložky.
Preto sa skúška obsahu, analýza vlhkosti a analýza protiiónov navzájom dopĺňajú.
Ako sa analyzujú protiióny?
Možné metódy sú:
- iónová chromatografia;
- kapilárna elektroforéza;
- NMR;
- elementárna analýza;
- prístup založený na hmotnostnej bilancii;
- špecifická analýza TFA.
Zvolená metóda závisí od protiiónu a požadovanej presnosti.
Čo je iónová chromatografia?
Iónová chromatografia je analytická technika na separáciu a meranie iónov.
Táto metóda sa môže použiť okrem iného na:
- chlorid;
- acetát;
- trifluóracetát;
- iné malé ióny.
Výsledok môže pomôcť pri výpočte soľnej formy a čistého obsahu peptidu.
Protiióny a rozpustnosť
Soľná forma peptidu môže ovplyvniť rozpustnosť.
Peptid vo forme acetátu sa môže správať inak ako ten istý peptid vo forme TFA alebo chloridu.
Rozpustnosť ovplyvňujú aj:
- aminokyselinová sekvencia;
- pH;
- koncentrácia;
- teplota;
- rozpúšťadlo;
- iónová sila.
Preto treba rozpustnosť vždy posudzovať špecificky pre daný produkt.
Protiióny a pH
Keď sa peptid rozpustí, protiióny môžu ovplyvniť pH roztoku.
Acetát, chlorid a TFA majú odlišné chemické vlastnosti.
pH môže byť relevantné pre:
- stabilita;
- deamidácia;
- agregácia;
- rozpustnosť;
- analytické metódy.
Protiióny a rozdiely medzi šaržami
Obsah protiiónov sa môže medzi šaržami líšiť.
Možné príčiny:
- metóda čistenia;
- použitá mobilná fáza;
- iónová výmena;
- premývacie kroky;
- lyofilizačný proces.
Preto je analýza špecifická pre danú šaržu dôležitá, keď sú protiióny relevantné pre účel výskumu.
Uvádza sa protiión v COA?
Niekedy áno, ale nie vždy.
COA môže uvádzať:
- forma peptidu;
- acetát;
- chlorid;
- TFA;
- percentuálny podiel protiiónov;
- analýza;
- čistý obsah peptidu.
Ak COA uvádza iba HPLC a MS, obsah protiiónov zvyčajne nebol úplne posúdený.
Prečo je to dôležité pre výpočty?
Pri výpočte množstva prítomného peptidu môže byť rozdiel medzi hrubou a čistou hmotnosťou dôležitý.
Napríklad:
- 10 mg celkového lyofilizovaného materiálu;
- 85 % čistý obsah peptidu;
- skutočné množstvo peptidu: 8,5 mg.
Bez korekcie môže byť množstvo peptidu nadhodnotené.
Vedecké obmedzenia
Analýza protiiónov závisí od použitej metódy.
Nie každá správa úplne špecifikuje formu soli.
Prítomných môže byť aj viacero iónových zložiek.
Preto by sa závery mali zakladať na skutočných analýzach, nielen na názve produktu alebo percente HPLC.
Zhrnutie
Protiióny sú ióny, ktoré kompenzujú elektrický náboj peptidov.
Bežné príklady:
- acetát;
- chlorid;
- TFA.
Môžu ovplyvniť:
- celková hmotnosť;
- čistý obsah peptidu;
- rozpustnosť;
- pH;
- stabilita;
- analytická interpretácia.
Vysoká HPLC čistota automaticky neznamená vysoký čistý obsah peptidu.
Na úplné posúdenie kvality sa musia protiióny hodnotiť spolu s HPLC, hmotnostnou spektrometriou, analýzou, zvyškovou vlhkosťou a údajmi o šarži.
Vylúčenie zodpovednosti týkajúce sa výskumu
Výskumné peptidy spoločnosti Peptidera sa ponúkajú výhradne na účely Research Use Only (RUO) a sú určené na laboratórny výskum a analytické aplikácie.
Nie je určené na konzumáciu ľuďmi ani zvieratami, diagnostické použitie, terapeutické účely ani samopodávanie.
Kategória:
Znalosti o peptidoch a kontrola kvality
Súvisiace interné blogy:
- PB-0233 — Analýza peptidu
- PB-0234 — Zvyšková vlhkosť
- PB-0230 — Čistota peptidov a HPLC
- PB-0232 — Certifikát analýzy
- PB-0237 — Deamidácia peptidov
Názov súboru obrázka:PB-0238-tegenionen-peptiden-acetaat-chloride-tfa.jpg
Alternatívny text:
Vedecká vizualizácia peptidových solných foriem s acetátovými, chloridovými a TFA protiiónmi v modernom analytickom laboratóriu.