Analiza aminokislin pri peptidih pojasnjena
Analiza aminokislin pri peptidih: razlaga sestave in kvantifikacije
Peptidi so sestavljeni iz verig aminokislin. Zaporedje teh aminokislin določa velik del kemijskih in strukturnih lastnosti peptida.
Pri preverjanju kakovosti se tehnike, kot sta HPLC in masna spektrometrija, pogosto uporabljajo za ocenjevanje čistosti in molekulske mase. Dopolnilna analizna metoda je analiza aminokislin, pogosto okrajšana kot AAA.
Analizo aminokislin je mogoče uporabiti za preučevanje:
- katere aminokisline so prisotne v vzorcu;
- kako se izmerjena aminokislinska razmerja ujemajo s pričakovano sestavo;
- koliko peptida je prisotnega;
- ali se aminokislinska sestava ujema s teoretičnim peptidom;
- kako je mogoče izračunati neto vsebnost peptida.
Metoda deluje drugače kot HPLC in masna spektrometrija. Pri klasični analizi aminokislin se peptidna veriga najprej razgradi na posamezne aminokisline. Nato se te aminokisline ločijo, zaznajo in kvantificirajo.
Analiza aminokislin lahko zagotovi dragocene informacije, vendar ima tudi omejitve. Med razgradnjo se lahko nekatere aminokisline delno spremenijo ali izgubijo. Zato je treba rezultate vedno razlagati v kontekstu uporabljene metode.
Kaj je analiza aminokislin?
Analiza aminokislin je laboratorijska tehnika, s katero se preučuje aminokislinska sestava vzorca.
Pri klasični analizi se običajno izvedejo naslednji koraki:
- priprava vzorca;
- hidroliza peptidne verige;
- sproščanje posameznih aminokislin;
- ločevanje aminokislin;
- detekcija in kvantifikacija;
- primerjava s pričakovano sestavo.
Rezultat je mogoče prikazati kot:
- količina posamezne aminokisline;
- molsko razmerje;
- masna koncentracija;
- profil aminokislin;
- izračunana vsebnost peptida.
Kaj je hidroliza?
Hidroliza je kemijski proces, pri katerem se vezi cepijo s pomočjo vode.
Pri analizi aminokislin se peptidne vezi razgradijo, tako da se sprostijo posamezne aminokisline.
Pogosto uporabljena metoda je kisla hidroliza.
Pri tem je vzorec določeno nadzorovano časovno obdobje izpostavljen:
- močna kislina;
- povišana temperatura;
- nadzorovanih pogojih.
Po hidrolizi prvotna peptidna veriga ne obstaja več kot neokrnjena molekula.
Sproščene aminokisline je nato mogoče preučiti posamezno.
Zakaj se peptidna veriga razgradi?
Neokrnjen peptid lahko vsebuje na desetine različnih aminokislinskih ostankov.
Z razgradnjo verige je mogoče izmeriti skupno količino vsake aminokisline.
Predpostavimo, da peptid vsebuje:
- štirje alaninski ostanki;
- dva glicinska ostanka;
- trije levcinski ostanki;
- en tirozinski preostanek.
Po hidrolizi je mogoče preveriti, ali izmerjena razmerja približno ustrezajo tej teoretični sestavi.
To podpira oceno aminokislinske sestave.
Kakšna je razlika med aminokislinsko sestavo in zaporedjem aminokislin?
Analiza aminokislin meri predvsem katere aminokisline so prisotne in v kakšni količini.
Metoda ne določi samodejno natančnega zaporedja.
Dva različna peptida imata lahko enako aminokislinsko sestavo, vendar drugačno zaporedje.
Na primer:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Oba vsebujeta:
- ena alaninska enota;
- ena glicina;
- ena levcinska enota.
Kljub temu je zaporedje drugačno.
Za preučevanje zaporedja so potrebne druge tehnike, kot so:
- tandemska masna spektrometrija;
- analiza fragmentov;
- posebne metode sekvenciranja.
Ali lahko analiza aminokislin potrdi identiteto?
Analiza aminokislin lahko potrdi pričakovano sestavo.
Če izmerjeni profil aminokislin močno odstopa od teoretične sestave, je to lahko povod za dodatno preiskavo.
Ujemajoči se profil pa sam po sebi ne dokazuje, da je natančno zaporedje aminokislin pravilno.
Za širšo oceno identitete je mogoče kombinirati:
- molekulska masa;
- LC-MS;
- MS/MS;
- analiza aminokislin;
- kromatografski podatki.
Kako se aminokisline ločujejo?
Po hidrolizi vzorec vsebuje zmes prostih aminokislin.
Te je treba analitsko ločiti med seboj.
Možne tehnike so:
- ionskoizmenjevalna kromatografija;
- HPLC;
- UPLC;
- kapilarna elektroforeza.
Izbrana tehnika je odvisna od:
- želena občutljivost;
- laboratorijska metoda;
- vrsta vzorca;
- zahtevana natančnost.
Kaj je derivatizacija?
Številne aminokisline so brez dodatne obdelave le omejeno zaznavne.
Zato jih je mogoče kemično povezati z zaznavno skupino.
To se imenuje derivatizacija.
Derivatizacija lahko poteka:
- pred kromatografsko ločitvijo;
- po kromatografski ločitvi.
Nastale derivate je mogoče bolje izmeriti na primer z:
- zaznavanje z UV;
- fluorescenčno zaznavanje;
- masna spektrometrija.
Derivatizacija pred kolono
Pri derivatizaciji pred kolono se aminokisline označijo pred kromatografsko ločitvijo.
Nato se nastali derivati ločijo s kolono.
Možne prednosti so:
- visoka občutljivost;
- ustrezno fluorescenčno zaznavanje;
- analiza več aminokislin.
Reakcija mora potekati ponovljivo.
Nepopolna derivatizacija lahko vpliva na kvantifikacijo.
Derivatizacija po koloni
Pri derivatizaciji po koloni se aminokisline najprej ločijo.
Po koloni reagirajo z detekcijskim reagentom.
Znan primer je analiza z ninhidrinom.
Nastali reakcijski produkti se lahko nato optično izmerijo.
Kako se določi količina aminokisline?
Za kvantifikacijo se uporabljajo referenčni standardi.
Standardne raztopine vsebujejo znane količine aminokislin.
Te se izmerijo, da se določi povezava med:
- koncentracija;
- signal detektorja.
Nato se izmeri neznani vzorec.
S pomočjo kalibracijskih podatkov je mogoče izračunati količino vsake aminokisline.
Kaj je interni standard?
Interni standard je znana snov, ki se doda vzorcem in kalibracijskim raztopinam.
Ta lahko pomaga popraviti odstopanja med:
- priprava vzorca;
- injiciranje;
- derivatizacija;
- analiza.
Interni standard se mora analitsko dobro razlikovati od preučevanih aminokislin.
Kako lahko aminokislinska analiza določi vsebnost peptida?
Ko je aminokislinska sestava peptida znana, je mogoče izbrane aminokisline uporabiti za izračun količine peptida.
Predpostavimo, da vsaka peptidna veriga vsebuje natanko štiri alaninske ostanke.
Ko se izmeri skupna količina alanina, je iz nje mogoče oceniti, koliko peptidnih verig je bilo prisotnih.
Pri izračunu se upošteva:
- število ostankov na peptid;
- molekulska masa;
- izmerjena količina aminokisline;
- analizna metoda.
To se lahko uporabi za kvantitativni test peptida.
Zakaj se ne uporabljajo vedno vse aminokisline?
Vsaka aminokislina ni enako primerna za kvantifikacijo.
Nekatere aminokisline se lahko med hidrolizo:
- delno se razgradijo;
- kemično se spremenijo;
- sproščanje je nepopolno;
- jih je težko zanesljivo izmeriti.
Zato se pogosto izberejo stabilne aminokisline.
Izbira je odvisna od zaporedja peptida in analitske metode.
Katere aminokisline se lahko med hidrolizo spremenijo?
Kislinska hidroliza ima lahko različne učinke.
Triptofan
Triptofan se lahko med standardno kislo hidrolizo večinoma razgradi.
Zato so potrebne prilagojene metode, kadar je treba triptofan izmeriti specifično.
Asparagin
Asparagin se lahko med hidrolizo pretvori v aspartat.
Zato se asparagin in aspartat pri klasični analizi ne poročata vedno ločeno.
Glutamin
Glutamin se lahko pretvori v glutamat.
Tako je mogoče glutamin in glutamat prikazati skupaj.
Serin
Serin se lahko med dolgotrajno hidrolizo delno izgubi.
Treonin
Tudi treonin lahko delno razgradi.
Cistein
Cistein je lahko podvržen oksidativnim spremembam.
Za zanesljivo analizo sta lahko potrebni predhodna oksidacija ali prilagojena metoda.
Zakaj je čas hidrolize pomemben?
Peptidne vezi je treba dovolj razgraditi.
Prekratka hidroliza lahko povzroči:
- nepopolna razgradnja;
- prenizke izmerjene vrednosti aminokislin.
Predolga hidroliza lahko povzroči:
- nadaljnja razgradnja občutljivih aminokislin;
- izguba pri merjenju.
Zato se čas in temperatura hidrolize nadzorujeta.
Včasih se uporablja več časov hidrolize za preučevanje izgube ali nepopolne razgradnje.
Kaj je molsko razmerje?
Molsko razmerje opisuje relativno število aminokislin.
Predpostavimo, da peptid teoretično vsebuje:
- dve alanini;
- ena glicina;
- tri levcine.
Teoretično molsko razmerje je:
2 : 1 : 3
Po analizi je mogoče izmerjene vrednosti normalizirati.
Ko je razmerje blizu teoretični vrednosti, to potrjuje pričakovano aminokislinsko sestavo.
Majhna odstopanja lahko nastanejo zaradi:
- merilna negotovost;
- izguba pri hidrolizi;
- derivatizacija;
- integracija kromatografskih vrhov.
Kaj pomeni normalizacija?
Pri normalizaciji se izmerjene vrednosti aminokislin preračunajo v relativna razmerja.
Ustrezna aminokislina se lahko uporabi kot referenca.
Tako je mogoče izmerjeni profil primerjati s teoretično sestavo.
Normalizacija je koristna za preučevanje sestave, vendar ne zagotavlja samodejno absolutne količine peptida.
Analiza aminokislin v primerjavi s čistostjo HPLC
Čistost HPLC in analiza aminokislin merita različne lastnosti.
Čistost HPLC običajno preučuje:
- glavni kromatografski vrh;
- relativna količina stranskih vrhov.
Analiza aminokislin preučuje:
- aminokislinska sestava;
- količina izbranih aminokislin;
- morebitna kvantifikacija peptidov.
Visoka čistost HPLC ne dokazuje samodejno, da je aminokislinska sestava pravilna.
Ustrezna aminokislinska sestava ne dokazuje samodejno, da ni prisotnih nečistoč, povezanih s peptidi.
Tehniki se dopolnjujeta.
Analiza aminokislin v primerjavi z masno spektrometrijo
Masna spektrometrija preučuje razmerje med maso in nabojem molekul.
Meritev neokrnjene mase lahko potrdi, da se molekulska masa ujema s teoretično vrednostjo.
Analiza aminokislin preučuje količino in razmerje aminokislin po razgradnji.
Obe tehniki imata različne prednosti.
Kombinacija lahko zagotovi več informacij o:
- identiteta;
- sestava;
- vsebnost peptida.
Analiza aminokislin v primerjavi z določanjem peptida
Analiza aminokislin se lahko uporablja tudi kot metoda določanja.
Analiza peptida opredeljuje cilj:
določiti količino peptida.
Analiza aminokislin je ena od tehnik, s katerimi je mogoče doseči ta cilj.
Druge možne metode določanja so:
- kvantitativna HPLC;
- UV-spektrofotometrija;
- kvantifikacija z LC-MS;
- masna bilanca.
Kakšen vpliv imajo protiioni?
Protiioni, kot so:
- acetat;
- klorid;
- TFA;
prispevajo k skupni masi liofiliziranega materiala.
Pri analizi aminokislin se preučujejo predvsem aminokislinske komponente peptida.
Tako lahko metoda pomaga razlikovati med:
- skupna masa materiala;
- dejanska količina peptida.
Za popolno masno bilanco so lahko potrebne dodatne analize.
Kakšen vpliv ima preostala vlaga?
Preostala vlaga prispeva k skupni masi, ne pa k sestavi aminokislin.
Pri izračunu neto vsebnosti peptida lahko analiza vlage zagotovi dodatne informacije.
Celovita masna bilanca lahko vključuje:
- vsebnost peptida;
- vsebnost vode;
- vsebnost protiionov;
- druge komponente.
Ali lahko analiza aminokislin pokaže kontaminante?
Nekateri nenavadni signali aminokislin lahko kažejo na nepričakovane komponente.
Vendar metoda ni zasnovana za zaznavanje vsake možne nečistote.
Za naslednje so lahko potrebne druge tehnike:
- organske nečistote;
- preostala topila;
- kovine;
- mikrobiološka kontaminacija;
- endotoksini.
Kaj je lahko navedeno na COA?
Certifikat analize lahko vsebuje informacije, kot so:
- preskus: analiza aminokislin;
- analizna metoda;
- izmerjena razmerja aminokislin;
- teoretična razmerja;
- izračunana vsebnost peptida;
- datum preskusa;
- številka serije.
Vsak COA ne vsebuje analize aminokislin.
Če sta bila izvedena samo HPLC in MS, iz tega ni mogoče izpeljati popolne kvantifikacije aminokislin.
Zakaj je povezava s serijo pomembna?
Analiza aminokislin mora biti povezana s preiskovano serijo.
Pomembni podatki so:
- številka serije;
- ime izdelka;
- datum analize;
- laboratorij;
- analizna metoda.
Analizno poročilo brez jasne povezave s serijo ima manjšo vrednost za sledljivost.
Kaj pomeni merilna negotovost?
Vsaka kvantitativna analiza vključuje merilno negotovost.
Pri analizi aminokislin so lahko viri variabilnosti:
- priprava vzorca;
- hidroliza;
- izguba aminokislin;
- derivatizacija;
- kalibracija;
- kromatografska ločba;
- integracija vrhov.
Zato rezultatov ne smemo obravnavati kot popolnoma brezhibnih.
Zakaj je validacija metode pomembna?
Metoda mora biti primerna za predvideni namen.
Pri kvantitativni analizi aminokislin so lahko pomembne validacijske značilnosti:
- točnost;
- natančnost;
- linearnost;
- specifičnost;
- merilno območje;
- robustnost;
- ponovljivost.
Metoda, primerna za kvalitativni aminokislinski profil, ni samodejno zadostna za natančno kvantifikacijo peptida.
Znanstvene omejitve
Analiza aminokislin ima pomembne omejitve.
Metoda ne določa samostojno:
- natančno zaporedje aminokislin;
- molekulska masa;
- čistost HPLC;
- tridimenzionalna struktura;
- biološka aktivnost;
- sterilnost;
- vsebnost endotoksinov.
Poleg tega se lahko nekatere aminokisline med hidrolizo spremenijo.
Za celovito oceno kakovosti je treba kombinirati več analitskih tehnik.
Povzetek
Analiza aminokislin preučuje sestavo in količino aminokislin v peptidu.
Pri klasični analizi se peptidna veriga najprej razgradi s hidrolizo.
Nato se aminokisline:
- ločene;
- zaznane;
- kvantificirane;
- v primerjavi s teoretično sestavo.
Analiza aminokislin se lahko uporablja za:
- nadzor aminokislinske sestave;
- ocena molskih razmerij;
- kvantifikacija vsebnosti peptida;
- podpora identifikaciji.
Metoda ima omejitve, ker se lahko nekatere aminokisline med hidrolizo spremenijo.
Zato se analiza aminokislin po možnosti kombinira z:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- peptidni test;
- analiza preostale vlage;
- analiza protiionov.
Izjava o omejitvi odgovornosti za raziskovalne izdelke
Raziskovalni peptidi Peptidera so na voljo izključno za Research Use Only (RUO) in so namenjeni laboratorijskim raziskavam ter analitičnim aplikacijam.
Ni namenjeno za prehrano ljudi ali živali, diagnostično uporabo, terapevtsko uporabo ali samostojno uporabo.
Znanje o peptidih & nadzor kakovosti
Sorodni izdelki Peptidera:
Liofilizirani raziskovalni peptidi z identifikacijo serije in razpoložljivimi analitičnimi podatki o kakovosti
Sorodni notranji spletni dnevniki:
- PB-0230 — Čistost peptidov in HPLC
- PB-0231 — Masna spektrometrija pri peptidih
- PB-0233 — Peptidni test: čistost v primerjavi z vsebnostjo peptida
- PB-0234 — Preostala vlaga v liofiliziranih peptidih
- PB-0238 — Protiioni pri peptidih
Predlogi notranjih povezav:
- Povezava do PB-0233 o analizi aminokislin kot peptidnem testu
- Povezava do PB-0230 o razliki glede na čistost HPLC
- Povezava do PB-0231 o molekulski masi in analizi zaporedja
- Povezava do PB-0234 o preostali vlagi in neto vsebnosti peptida
- Povezava do PB-0238 o protiionih in masnem ravnotežju
- Povezava do strani Peptidera s certifikati analiz
- Povezava do zbirke raziskovalnih peptidov