Masna spektrometrija pri peptidih pojasnjena

Masna spektrometrija pri peptidih: kako se preučuje molekulska identiteta?

Pri nadzoru kakovosti raziskovalnih peptidov se pogosto kombinira več analitskih tehnik. HPLC lahko zagotovi informacije o kromatografski čistosti, vendar visok glavni vrh samodejno ne dokazuje, da je prisoten pravi peptid.

Za nadaljnje preučevanje molekulske identitete se pogosto uporablja masna spektrometrija.

Masna spektrometrija, običajno skrajšana na MS, je analitska tehnika za merjenje razmerja med maso in nabojem ioniziranih molekul. Pri analizi peptidov je mogoče izmerjeno molekulsko maso primerjati s teoretično pričakovano maso zaporedja aminokislin.

Ko se ti vrednosti ujemata, to podpira identifikacijo preučevanega peptida. Vendar tudi masna spektrometrija sama po sebi ne zagotavlja popolne slike kakovosti.

V tem blogu obravnavamo, kako deluje masna spektrometrija, zakaj lahko peptidi tvorijo več masnih signalov in kako se rezultati MS razlagajo skupaj s HPLC ter drugimi analitskimi metodami.

---

Kaj je masna spektrometrija?

Masna spektrometrija je analitska tehnika, pri kateri se molekule pretvorijo v nabite delce oziroma ione.

Ti ioni se nato ločijo in izmerijo na podlagi njihovega razmerja med maso in nabojem.

To razmerje je prikazano kot:

m/z

Pri tem:

• m za maso;
• z za električni naboj.

Masni spektrometer torej ne meri vedno neposredno celotne molekulske mase. Instrument meri razmerje med maso in nabojem.

Pri večjih molekulah, vključno s številnimi peptidi, lahko nastane več nabojev. Zato je lahko isti peptid v masnem spektru viden na različnih mestih.

---

Zakaj se masna spektrometrija uporablja pri analizi peptidov?

Peptid je sestavljen iz specifičnega zaporedja aminokislin.

Vsaka kombinacija aminokislin ima teoretično izračunljivo molekulsko maso.

Masno spektrometrijo je mogoče uporabiti za preverjanje, ali izmerjena masa ustreza tej teoretični vrednosti.

Analiza MS lahko prispeva k:

• potrditev molekulske identitete;
• primerjava s teoretično molekulsko maso;
• zaznavanje nekaterih kemijskih modifikacij;
• analiza razgradnih produktov;
• raziskava različic peptidov;
• primerjava med proizvodnimi serijami.

Ustrezna masa podpira identiteto peptida.

Vendar je treba rezultat vedno oceniti v povezavi z analitsko metodo in drugimi podatki o kakovosti.

---

Kakšna je teoretična molekulska masa?

Teoretična molekulska masa se izračuna na podlagi:

• zaporedje aminokislin;
• število aminokislin;
• morebitne kemične modifikacije;
• molekulska oblika;
• specifične končne skupine.

Ko aminokisline skupaj tvorijo peptidno verigo, nastanejo peptidne vezi.

Med tvorbo vsake peptidne vezi se odcepi molekula vode. Zato masa celotnega peptida ni preprosto vsota vseh posameznih aminokislin.

Maso lahko vplivajo tudi modifikacije.

Primeri so:

• amidacija;
• acetilacija;
• fosforilacija;
• oksidacija;
• dodajanje maščobnokislinskih verig;
• tvorba disulfidnih mostičkov.

Teoretično maso je zato treba izračunati za natančno molekulsko strukturo.

---

Kaj pomeni molekulska teža?

Izraza molekulska masa in molekulska teža se pogosto uporabljata izmenično.

V laboratorijskih poročilih je vrednost običajno navedena v:

• dalton, skrajšano Da;
• kilodalton, skrajšano kDa.

En dalton približno ustreza masi enega vodikovega atoma.

Peptid z molekulsko maso 3.000 Da ima torej maso približno 3 kDa.

Molekulska masa peptidov se lahko močno razlikuje glede na:

• dolžina verige;
• sestava aminokislin;
• kemijske modifikacije.

---

Kako deluje masni spektrometer?

Masni spektrometer je običajno sestavljen iz več delov.

1. Vnos vzorca

Peptid se najprej pripravi in vnese v instrument.

Na pripravo vzorca lahko vplivajo:

• jakost signala;
• zaznavnost;
• nastajanje ionov;
• signali ozadja.

2. Ionizacija

Molekule se električno nabijejo.

Pogosto uporabljeni tehniki za analizo peptidov sta:

• ionizacija z električnim razprševanjem;
• matrično podprta laserska desorpcija/ionizacija.

3. Analiza mase

Nastali ioni se ločijo na podlagi razmerja med maso in nabojem.

4. Zaznavanje

Detektor zazna ione.

5. Obdelava podatkov

Izmerjeni signali se pretvorijo v masni spekter.

Ta spekter vsebuje vrhove, ki ustrezajo zaznanim ionom.

---

Kaj je ionizacija z električnim razprševanjem?

Ionizacija z električnim razprševanjem, skrajšano ESI, je pogosto uporabljena ionizacijska tehnika za peptide.

Med ESI se tekoči vzorec vodi skozi majhno odprtino, pri tem pa se dovaja električna napetost.

Tako nastanejo električno nabite kapljice.

Ko topilo izhlapi, ostanejo nabite molekule.

Pomembna značilnost ESI je, da lahko večje molekule pridobijo več električnih nabojev.

Peptid se lahko na primer pojavi kot:

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

Pri tem M označuje molekulsko maso peptida.

Zaradi več nabojev nastanejo različni signali m/z za isto molekulo.

---

Zakaj ima en peptid več vrhov?

Ko peptid sprejme več protonov, nastanejo različne ionske oblike.

Predpostavimo, da ima peptid molekulsko maso približno 3.000 Da.

Možni signali so približno:

• en pozitivni naboj: m/z približno 3.001;
• dva pozitivna naboja: m/z približno 1.501;
• trije pozitivni naboji: m/z približno 1.001.

Vsi ti signali lahko pripadajo istemu peptidu.

Programska oprema lahko to porazdelitev nabojev uporabi za izračun prvotne molekulske mase.

Ta proces se imenuje dekonvolucija.

---

Kaj je dekonvoluirani masni spekter?

Surova meritev ESI lahko vsebuje več vrhov z različnimi naboji.

To lahko oteži interpretacijo.

Programska oprema za dekonvolucijo različne nabite oblike preračuna v eno ocenjeno molekulsko maso.

Dekonvoluirani spekter je zato mogoče lažje primerjati z:

• teoretične mase;
• referenčnega standarda;
• specifikacij izdelka.

Kakovost izračuna je odvisna od:

• jakost signala;
• ločljivost;
• šum ozadja;
• nastavitve programske opreme;
• prisotnosti prekrivajočih se komponent.

---

Kaj je MALDI?

Ionizacija z lasersko desorpcijo, podprto z matrico, skrajšano MALDI, je druga ionizacijska tehnika.

Peptid se zmeša z matričnim materialom in nanese na merilno ploščico.

Laser aktivira matrico, zaradi česar nastanejo peptidni ioni.

MALDI pogosto tvori predvsem enkrat nabite ione.

Zato je lahko spekter videti preprostejši kot spekter ESI.

MALDI se pogosto kombinira z masnim analizatorjem time-of-flight.

Ta kombinacija se imenuje:

MALDI-TOF

---

Kaj je time-of-flight?

Pri masnem analizatorju time-of-flight se ioni pospešijo z električnim poljem.

Nato potujejo skozi merilno cev.

Ioni z manjšim razmerjem med maso in nabojem običajno dosežejo detektor hitreje kot ioni z večjim razmerjem.

Čas preleta se uporablja za izračun vrednosti m/z.

Sisteme TOF je mogoče uporabiti za:

• identifikacija peptidov;
• določitev mase;
• primerjavi molekularnih različic.

Končna natančnost je odvisna od kalibracije, nastavitev instrumenta in priprave vzorca.

---

Kaj je LC-MS?

Tekočinska kromatografija-masna spektrometrija, skrajšano LC-MS, združuje tekočinsko kromatografijo z masno spektrometrijo.

Komponente se najprej kromatografsko ločijo.

Nato masni spektrometer analizira posamezne signale.

LC-MS lahko združi informacije o:

• zadrževalni čas;
• kromatografski profil;
• molekulska masa;
• morebitnih nečistočah;
• razgradnih produktih.

LC-MS lahko zato zagotovi več vpogleda kot ločena analiza HPLC ali MS.

---

Kakšna je razlika med HPLC in masno spektrometrijo?

HPLC in masna spektrometrija odgovarjata na različna analitska vprašanja.

HPLC

HPLC lahko zagotovi informacije o:

• kromatografsko čistost;
• relativna količina zaznanih komponent;
• zadrževalni časi;
• spremembe v kromatografskem profilu.

Masna spektrometrija

Masna spektrometrija lahko zagotovi informacije o:

• molekulska masa;
• možna identiteta;
• kemijske modifikacije;
• določeni razgradni produkti.

Poenostavljena primerjava:

Zato se obe tehniki pogosto kombinirata.

---

Ali se lahko pri različnih peptidih pojavi enaka molekulska masa?

Da.

Različna zaporedja aminokislin imajo lahko enako ali skoraj enako skupno maso.

Temu včasih pravimo izobare strukture.

Ujemanje mase zato ne dokazuje vedno, da je celotno zaporedje aminokislin pravilno.

Za podrobnejšo identifikacijo so morda potrebne dodatne tehnike, kot so:

• tandemska masna spektrometrija;
• fragmentacijska analiza;
• analiza aminokislin;
• analiza zaporedja;
• primerjava z referenčnim standardom.

Potrebna analizna metoda je odvisna od želene stopnje gotovosti.

---

Kaj je tandemska masna spektrometrija?

Tandemska masna spektrometrija se običajno zapisuje kot:

MS/MS

Med MS/MS se izbrani peptidni ion dodatno fragmentira.

Nastali fragmenti se nato ponovno izmerijo.

Fragmentacijski vzorec lahko zagotovi informacije o:

• zaporedje aminokislin;
• lokacija modifikacij;
• identiteta peptida;
• struktura razgradnih produktov.

MS/MS lahko tako zagotovi več strukturnih informacij kot samo nedotaknjena molekulska masa.

---

Kaj so peptidni fragmenti?

Ko se peptidna veriga med MS/MS pretrga na specifičnih mestih, nastanejo fragmentni ioni.

Pogosti tipi fragmentov so:

• ioni b;
• ioni y.

Mase teh fragmentov je mogoče uporabiti za rekonstrukcijo delov aminokislinskega zaporedja.

Interpretacija je lahko zapletena.

Vsak peptid ne fragmentira na enak način.

Vplivajo lahko naslednji dejavniki:

• sestava aminokislin;
• električni naboj;
• velikost peptida;
• fragmentacijska metoda;
• kemijske modifikacije.

---

Ali lahko masna spektrometrija zazna oksidacijo?

Določene oksidativne spremembe povzročijo merljivo spremembo mase.

Dodatek enega atoma kisika na primer pogosto povzroči povečanje mase za približno 16 Da.

Masna spektrometrija lahko tako pomaga identificirati določene oksidacijske produkte.

Zaznavanje je odvisno od:

• koncentracija;
• ločljivost instrumenta;
• analizna metoda;
• ločevanje komponent.

Vsake oksidativne spremembe ni mogoče v celoti lokalizirati samo na podlagi enega masnega signala.

Za to je morda potrebna dodatna fragmentacijska analiza.

---

Ali lahko masna spektrometrija določi količino peptida?

Ne samodejno.

Na intenzivnost masnega signala vplivajo:

• učinkovitost ionizacije;
• molekulske lastnosti;
• topilo;
• nastavitve instrumenta;
• prisotnost drugih sestavin.

Dvakrat močnejši signal zato ne pomeni samodejno, da je prisotne dvakrat več peptida.

Za zanesljivo kvantifikacijo so potrebne validirane metode in ustrezni standardi.

Možne tehnike so:

• kvantitativna LC-MS;
• notranji standardi;
• izotopsko označeni referenčni standardi;
• umerjeni testi HPLC.

---

Ali lahko masna spektrometrija dokaže sterilnost?

Ne.

Masna spektrometrija za identifikacijo peptida ni preskus sterilnosti.

Rezultat ne zagotavlja neposrednih informacij o:

• bakterije;
• glive;
• rast mikroorganizmov;
• sterilnost izdelka.

Sterilnost zahteva posebne mikrobiološke preskusne metode.

Tudi endotoksini se med standardno analizo peptida z MS ne določajo samodejno.

---

Ali lahko masna spektrometrija meri endotoksine?

Ne s standardno analizo identitete.

Endotoksini so kompleksne bakterijske sestavine.

Za preiskavo endotoksinov se uporabljajo posebne metode, kot so:

• test z lizatnim reagentom amebocitov Limulus;
• metode rekombinantnega faktorja C.

Pravilen masni spekter peptida zato ne dokazuje, da ima material nizko vsebnost endotoksinov.

Identiteta, čistost, sterilnost in endotoksini so ločeni parametri kakovosti.

---

Zakaj se lahko laboratorijski rezultati razlikujejo?

Različni laboratoriji lahko poročajo o nekoliko različnih masnih vrednostih.

Možni vzroki so:

• vrsta instrumenta;
• kalibracija;
• metoda ionizacije;
• priprava vzorca;
• solni adukti;
• uporabljena programska oprema;
• ločljivost;
• metoda interpretacije.

Majhne razlike ne pomenijo samodejno, da je rezultat napačen.

Izmerjeno vrednost je treba oceniti v okviru:

• natančnost instrumenta;
• pričakovana molekulska oblika;
• uporabljena analizna metoda.

---

Kaj so addukti?

Med masno spektrometrijo se lahko peptidni ioni povežejo z drugimi nabitimi delci.

Primeri so:

• natrij;
• kalij;
• amonij.

Zato lahko nastanejo dodatni vrhovi.

Natrijev addukt ima na primer drugačno maso kot preprost protoniran peptidni ion.

Addukti ne pomenijo samodejno, da je prisoten drug peptid.

Razlaga zahteva poznavanje:

• priprava vzorca;
• uporabljeni pufri;
• pričakovane ionske oblike.

---

Katere informacije sodijo v poročilo MS?

Profesionalno analizno poročilo lahko med drugim vsebuje:

• ime peptida;
• številka serije ali lota;
• teoretična molekulska masa;
• izmerjena molekulska masa;
• metoda ionizacije;
• vrsta masnega spektrometra;
• masni spekter;
• datum analize;
• ime laboratorija.

Pri obsežnejši analizi se lahko navedejo tudi:

• merilno območje;
• ločljivost;
• masna natančnost;
• podatki o fragmentaciji;
• uporabljena programska oprema.

Potrebno poročanje je odvisno od raziskovalnega cilja.

---

Masna spektrometrija in nadzor serij

Vsako proizvodno serijo je mogoče preučiti ločeno.

Analiza MS, specifična za serijo, podpira:

• preverjanje identitete;
• primerjavo med serijami;
• sledljivost;
• preiskavo odstopanj.

Številka serije na poročilu o analizi se mora ujemati z identifikacijo na viali.

Rezultat masne spektrometrije brez jasne povezave s serijo ima omejeno vrednost za sledljivost.

---

Znanstvene omejitve

Masna spektrometrija je zmogljiva analitska tehnika, vendar ne zagotavlja celovite ocene kakovosti.

Ujemajoča se molekulska masa ne dokazuje samodejno:

• celotno aminokislinsko zaporedje;
• visoko kromatografsko čistost;
• ustrezno količino peptida;
• sterilnost;
• nizko vsebnost endotoksinov;
• biološko aktivnost;
• dolgotrajno stabilnost.

Za širšo oceno je lahko potrebnih več metod:

• HPLC;
• LC-MS;
• MS/MS;
• kvantitativno analizo;
• test stabilnosti;
• analizo vlage;
• dodatne preskuse, specifične za izdelek.

Rezultate je treba razlagati skupaj.

---

Povzetek

Masna spektrometrija se uporablja za preučevanje molekulske mase raziskovalnih peptidov.

Tehnika meri razmerje med maso in nabojem ioniziranih molekul.

Pri analizi peptidov je mogoče izmerjeno maso primerjati s teoretično pričakovano maso.

Ujemanje podpira molekularno identifikacijo.

Pomembne analitske tehnike so:

• ESI-MS;
• MALDI-TOF;
• LC-MS;
• MS/MS.

Masna spektrometrija pa ne zagotavlja samodejno informacij o:

• točno količino;
• kromatografsko čistost;
• sterilnost;
• endotoksine;
• biološko aktivnost.

Zato se MS pogosto kombinira s HPLC in dodatnimi analizami kakovosti.

---

Izjava o omejitvi odgovornosti za raziskovalne izdelke

Raziskovalni peptidi Peptidere so na voljo izključno za uporabo v raziskavah (RUO) ter so namenjeni laboratorijskim raziskavam in analitičnim uporabam.

Ni namenjeno uživanju pri ljudeh ali živalih, diagnostični uporabi, terapevtski uporabi ali samostojnemu dajanju.

---

Kategorija:
Znanje o peptidih in nadzor kakovosti

Sorodni izdelki Peptidera:
Liofilizirani raziskovalni peptidi z identifikacijo serije in razpoložljivimi analitičnimi podatki o kakovosti

Sorodni interni blogi:

• PB-0227 — Liofilizirani peptidi in liofilizacija
• PB-0228 — Viale s peptidi in celovitost embalaže
• PB-0229 — Številke serij in sledljivost
• PB-0230 — Čistost peptidov in HPLC
• Kaj je potrdilo o analizi?

Predlogi notranjih povezav:

• Povezava do PB-0230 o razliki med HPLC in MS
• Povezava do PB-0229 pri analizi, specifični za serijo
• Povezava do strani s potrdili o analizi pri rezultatih masne spektrometrije
• Povezava do zbirke raziskovalnih peptidov
• Povezava do strani o neodvisni laboratorijski analizi