Razloženi peptidni referenčni standardi
Peptidni referenčni standardi: zakaj je analitska primerjava pomembna
Pri analizi kakovosti raziskovalnih peptidov se pogosto uporabljajo tehnike, kot so:
- HPLC;
- LC-MS;
- določanje vsebnosti peptida;
- analiza aminokislin;
- UV-spektrofotometrija.
Ti instrumenti ustvarjajo merilne podatke, vendar signal detektorja ali kromatografski vrh nima samodejno natančnega pomena.
Za zanesljivo identifikacijo ali kvantifikacijo neznanega vzorca ga je mogoče primerjati z materialom, katerega relevantne lastnosti so bile že skrbno določene.
Tak material se imenuje referenčni standard.
Dobro karakteriziran peptidni referenčni standard se lahko uporablja za:
- identifikacija;
- primerjava retencijskih časov;
- kvantifikacija;
- kalibracija;
- ocenjevanje HPLC-metod;
- preiskava nečistot;
- analiza razgradnih produktov;
- podpora meroslovni sledljivosti.
Kakovost analitskega rezultata zato ni odvisna le od laboratorijskega instrumenta. Pomembni so tudi identiteta, čistost, vsebnost peptida, shranjevanje in dokumentacija uporabljenega referenčnega standarda.
Referenčni standard poleg tega ni samodejno enak naključnemu vzorcu z visokim deležem HPLC. Za kvantitativno uporabo mora biti jasno, koliko dejanskega peptida je prisotnega in katere nepeptidne komponente prispevajo k skupni masi.
V tem prispevku obravnavamo, kaj so peptidni referenčni standardi, kako se primarni in sekundarni standardi razlikujejo ter zakaj je analitska primerjava pomembna za zanesljivo analizo peptidov.
Kaj je peptidni referenčni standard?
Peptidni referenčni standard je skrbno karakteriziran material, ki se uporablja kot primerjalna osnova med laboratorijsko analizo.
Glede na cilj raziskave se lahko določijo lastnosti, kot so:
- zaporedje aminokislin;
- molekulska masa;
- identiteta;
- HPLC-čistost;
- vsebnost peptida;
- vsebnost vode;
- vsebnost protijonov;
- prisotnost relevantnih nečistot;
- stabilnost pri shranjevanju.
Standard se lahko nato uporabi za analitsko primerjavo neznanega vzorca.
Potrebna karakterizacija je odvisna od namena uporabe.
Standard za identifikacijo ni vedno treba izpolnjevati povsem enakih zahtev kot standard za kvantitativno analizo.
Zakaj je potrebna analitska primerjava?
Laboratorijski instrument meri fizikalni ali kemijski signal.
Primeri so:
- absorpcija UV;
- fluorescenca;
- površina kromatografskega vrha;
- razmerje med maso in nabojem;
- intenzivnost ionov.
Signal ni samodejno enak natančni količini peptida.
Za to je potrebna zanesljiva povezava med:
- znana količina;
- izmerjeni signal;
- neznani vzorec.
Referenčni standard lahko pomaga vzpostaviti to povezavo.
Preprost primer
Predpostavimo, da želi laboratorij s kvantitativno HPLC določiti količino peptida.
Laboratorij pripravi različne raztopine karakteriziranega referenčnega standarda:
- 0,1 mg/ml;
- 0,25 mg/ml;
- 0,5 mg/ml;
- 0,75 mg/ml;
- 1,0 mg/ml.
Vsaka raztopina se analizira.
Izmerjene površine vrhov se prikažejo glede na znane koncentracije.
Tako nastane kalibracijska krivulja.
Nato se izmeri neznani vzorec.
Koncentracijo je mogoče izračunati s primerjavo signala vzorca s kalibracijsko krivuljo.
Zanesljivost tega izračuna je med drugim odvisna od:
- kakovost referenčnega standarda;
- pravilen izračun koncentracije;
- natančno tehtanje;
- natančno pipetiranje;
- linearnost metode;
- stabilnost raztopin.
Kaj je primarni referenčni standard?
Primarni referenčni standard je material, katerega relevantne lastnosti so bile obsežno določene.
Standard je mogoče karakterizirati z več neodvisnimi analitskimi tehnikami.
Možne analize so:
- HPLC;
- LC-MS;
- analiza aminokislin;
- določanje vsebnosti vode;
- analiza protiionov;
- NMR;
- elementna analiza;
- masna bilanca.
Cilj je z visoko zanesljivostjo ugotoviti:
- kateri material je prisoten;
- kako čist je;
- koliko želene komponente je prisotne;
- kateri korekcijski faktorji so potrebni.
Primarni standard se nato lahko uporablja za kvalifikacijo drugih standardov.
Kaj je sekundarni referenčni standard?
Sekundarni referenčni standard se imenuje tudi:
- delovni standard;
- delovni standard;
- interni referenčni standard.
Ta standard se kvalificira s primerjavo s primarnim ali uradno priznanim referenčnim standardom.
Sekundarni standard se lahko uporablja za rutinske laboratorijske analize.
Možne prednosti so:
- večja razpoložljivost;
- nižji stroški;
- ohranjanje primarnega standarda;
- učinkovitejša rutinska uporaba.
Vendar je treba sekundarni standard redno preverjati in pravilno shranjevati.
Zakaj se primarni standard ne uporablja vedno?
Primarni standardi so lahko:
- omejeno razpoložljivi;
- dragi;
- dobavljeni v majhnih količinah;
- namenjeni specifičnim uradnim analitskim metodam.
S kvalifikacijo sekundarnega standarda glede na primarni standard je mogoče izvajati rutinske preiskave, ne da bi bilo treba primarni standard nenehno uporabljati.
Zanesljivost je odvisna od kakovosti kvalifikacije.
Kaj pomeni kvalifikacija delovnega standarda?
Kvalifikacija pomeni, da se lastnosti delovnega standarda sistematično preučijo in primerjajo z ustreznim referenčnim standardom.
Program kvalifikacije lahko vključuje:
- preverjanje identitete;
- HPLC-čistost;
- določanje vsebnosti peptida;
- vsebnost vode;
- vsebnost protijonov;
- primerjava kromatogramov;
- primerjava masnih spektrov;
- ocena stabilnosti.
Potrebni preskusi so odvisni od predvidene uporabe.
Identifikacija v primerjavi s kvantifikacijo
Referenčni standard ima lahko različne analitske funkcije.
Identifikacijski standard
Identifikacijski standard se uporablja za preverjanje, ali se neznani vzorec ujema s pričakovanim peptidom.
Možne primerjave so:
- HPLC-retencijski čas;
- molekulska masa;
- masnospektrometrični profil;
- spektroskopske lastnosti.
Kvantitativni standard
Kvantitativni standard se uporablja za določanje količine peptida.
Za to mora biti dejanska vsebnost peptida dovolj zanesljivo znana.
Samo visoka HPLC-čistost za to običajno ni zadostna.
Zakaj HPLC-čistost ni zadostna?
Peptid ima lahko na primer HPLC-čistost 99 %.
To ne pomeni samodejno, da je 99 % celotne mase sestavljenih iz peptida.
Material lahko poleg tega vsebuje:
- voda;
- acetat;
- klorid;
- TFA;
- soli;
- drugimi nekromatografsko izmerjenimi komponentami.
Pri kvantitativnem standardu je zato treba razlikovati med:
- kromatografska čistost;
- skupna masa materiala;
- neto vsebnost peptida.
Kaj je dodeljena vrednost?
Referenčni standard ima lahko dodeljeno vrednost.
Ta vrednost na primer opisuje:
- vsebnost peptida;
- čistost;
- koncentracija;
- potentnost;
- količina na pakiranje.
Dodeljena vrednost mora temeljiti na ustreznih analitskih podatkih.
Navede se lahko tudi korekcijski faktor.
Kaj je korekcijski faktor?
Korekcijski faktor se uporablja za preračun stehtane količine materiala v dejansko količino peptida.
Predpostavimo:
- stehtani material: 10,0 mg;
- dodeljena vsebnost peptida: 85 %;
- dejanska količina peptida: 8,5 mg.
Če se ta popravek ne uporabi, je lahko izračunana koncentracija precenjena.
Zakaj je neto vsebnost peptida pomembna?
Neto vsebnost peptida opisuje delež dejanskega peptida v preučevanem materialu.
Pri izračunu se lahko upoštevajo dejavniki, kot so:
- preostala vlaga;
- protiioni;
- organske komponente;
- anorganske komponente.
Za kvantitativno analizo je to pogosto pomembnejše kot samo kromatografska čistost HPLC.
Kakšno vlogo ima analiza aminokislin?
Analizo aminokislin je mogoče uporabiti za določitev vsebnosti peptida.
Peptidna veriga se pri tem hidrolizira v posamezne aminokisline.
Izbrane aminokisline se nato kvantificirajo.
Ko je znano, koliko teh aminokislin je prisotnih v vsaki peptidni verigi, je mogoče izračunati količino peptida.
Analiza aminokislin lahko zato prispeva k določitvi vrednosti referenčnega standarda.
Kakšno vlogo ima masna spektrometrija?
Masna spektrometrija lahko pomaga pri potrditvi:
- molekulska masa;
- identiteta;
- določene modifikacije;
- produkti razgradnje.
LC-MS lahko združuje kromatografsko ločevanje z masno detekcijo.
Ustrezna molekulska masa podpira identiteto, vendar sama po sebi ne dokazuje:
- natančna količina peptida;
- celotno zaporedje;
- odsotnost vseh nečistot.
Zato se pogosto kombinira več tehnik.
Kakšno vlogo ima MS/MS?
Pri tandemski masni spektrometriji se izbrani peptidni ion fragmentira.
Fragmenti lahko zagotovijo informacije o zaporedju aminokislin.
MS/MS lahko zato zagotovi dodatno podporo za:
- potrditev zaporedja;
- lokalizacija modifikacij;
- identifikacija razgradnih produktov.
Analitska zmogljivost je odvisna od:
- velikost peptida;
- fragmentacija;
- ločljivost instrumenta;
- obdelava podatkov.
Kakšna je vloga HPLC?
HPLC se lahko uporablja za:
- primerjava retencijskih časov;
- ocenjevanje kromatografske čistosti;
- preučevanje stranskih vrhov;
- kvantitativni test;
- preučevanje stabilnosti.
Pri primerjavi je treba referenco in vzorec analizirati z isto nadzorovano metodo.
Pomembni parametri so:
- vrsta kolone;
- mobilna faza;
- temperatura;
- pretok;
- valovna dolžina detekcije.
Kaj je kalibracijska krivulja?
Kalibracijska krivulja opisuje razmerje med znanimi koncentracijami in izmerjenimi signali detektorja.
Zanesljivo kalibracijsko krivuljo je treba oceniti glede na:
- linearnost;
- merilno območje;
- ponovljivost;
- odstopanja;
- ustreznost za analitsko metodo.
Neznana koncentracija se izračuna znotraj validiranega merilnega območja.
Ekstrapolacija zunaj tega območja lahko povzroči dodatno negotovost.
Kaj je linearnost?
Linearnost opisuje, v kolikšni meri se izmerjeni signal sorazmerno spreminja s koncentracijo.
Ko se koncentracija podvoji, se v linearnem območju pričakuje ustrezna sprememba signala.
Povezava ni nujno linearna za vsako metodo v celotnem koncentracijskem območju.
Zato se relevantno merilno območje eksperimentalno preuči.
Kaj pomeni analitska sledljivost?
Analitska ali metrološka sledljivost opisuje, kako je merilni rezultat prek dokumentirane primerjalne verige povezan s priznanim referenčnim standardom.
Pomembni elementi so:
- uporabljeni standard;
- certifikat;
- dodeljena vrednost;
- kalibracija;
- analitska metoda;
- merilna negotovost;
- dokumentacija.
Sledljivost podpira primerljivost rezultatov med:
- različni dnevi merjenja;
- laboratoriji;
- instrumenti;
- serije.
Kaj je metrološka sledljivost?
Metrologija je veda o merjenju.
Metrološka sledljivost zahteva dokumentirano in neprekinjeno primerjalno verigo do določenega referenčnega standarda. Vsak korak prispeva k skupni merilni negotovosti.
Pri analizi peptidov je praktična sledljivost med drugim lahko odvisna od:
- referenčni standard;
- dodeljena vsebnost peptida;
- umerjena tehtnica;
- volumetrična oprema;
- analitska metoda.
Kaj je merilna negotovost?
Vsaka analitska meritev vsebuje negotovost.
Možni viri so:
- negotovost referenčnega standarda;
- tehtanje;
- pipetiranje;
- redčenje;
- variabilnost instrumenta;
- kalibracija;
- integracija vrhov;
- priprava vzorca.
Merilna negotovost ne pomeni, da je rezultat nezanesljiv.
Opisuje ocenjeno območje, v katerem je lahko dejanska vrednost razumno pričakovana.
Zakaj morajo biti standardi specifični za serijo?
Tudi referenčni standardi se proizvajajo v serijah.
Različne serije se lahko razlikujejo v:
- vsebnost peptida;
- vsebnost vode;
- vsebnost protijonov;
- profil čistosti;
- stabilnost.
Zato mora biti jasno, katera številka serije referenčnega standarda je bila uporabljena.
Kaj je navedeno na certifikatu referenčnega standarda?
Certifikat lahko vsebuje informacije o:
- ime;
- kataloška številka;
- številka serije;
- dodeljena vrednost;
- predvidena uporaba;
- pogoji shranjevanja;
- informacije o veljavnosti;
- analizne metode;
- korekcijski faktor.
Vsak certifikat ne vsebuje istih podatkov.
Standard je treba uporabljati v skladu s pripadajočimi navodili.
Zakaj so pogoji shranjevanja pomembni?
Referenčni standard se lahko med shranjevanjem spremeni.
Možni procesi so:
- oksidacijo;
- deamidacijo;
- absorpcijo vlage;
- agregacijo;
- razgradnjo.
Zato se lahko določijo pogoji za:
- temperatura;
- zaščita pred svetlobo;
- zaščita pred vlago;
- uporaba po odprtju;
- doba shranjevanja.
Standard, ki je nepravilno shranjen, lahko povzroči napačne primerjave.
Kaj je rok uporabnosti?
Nekateri referenčni standardi imajo določen rok uporabnosti.
Drugi standardi imajo:
- preverjanje veljavnosti;
- datum ponovne kvalifikacije;
- trenutni status serije.
Laboratorij mora preveriti, ali je standard ob uporabi primeren in veljaven.
Kaj je ponovna kvalifikacija?
Ponovna kvalifikacija je ponovna ocena referenčnega standarda.
Možne analize so:
- HPLC;
- LC-MS;
- določanje vsebnosti peptida;
- vsebnost vode;
- primerjavi s primarnim standardom.
Ponovna kvalifikacija je morda potrebna po:
- vnaprej določena doba uporabe;
- dolgotrajno shranjevanje;
- sprememba videza;
- odstopajoči rezultat analize.
Zakaj so standardi nečistot pomembni?
Kot standard se lahko uporablja ne le želeni peptid.
Kot referenčni material lahko služijo tudi znane nečistote ali razgradni produkti.
Primeri so:
- oksidacijski produkti;
- deamidacijske različice;
- fragmenti;
- delecijske sekvence;
- komponente, povezane z agregacijo.
Ti standardi lahko pomagajo pri identifikaciji in kvantifikaciji stranskih vrhov.
Kaj so razgradni standardi?
Razgradni standard predstavlja znano razgradno različico.
Ta se lahko uporabi za preverjanje:
- kje se razgradni produkt eluira;
- katera molekulska masa je prisotna;
- kako občutljiva je analizna metoda;
- koliko razgradnega produkta je prisotnega.
Vsak razgradni produkt ni na voljo kot čisti standard.
Referenčni standardi in validacija metode
Analizna metoda mora biti dokazano primerna za predvideni namen.
ICH Q2(R2) opisuje načela za validacijo analiznih postopkov. Ustrezne značilnosti lahko med drugim vključujejo specifičnost, točnost, natančnost, linearnost in merilno območje.
Referenčni standardi se lahko uporabljajo pri preverjanju:
- točnost;
- specifičnost;
- linearnost;
- kvantitativno območje;
- zmogljivost metode.
Kaj je točnost?
Točnost opisuje, kako blizu je izmerjeni rezultat sprejeti referenčni vrednosti.
Dobro opredeljen standard se lahko uporabi za preverjanje točnosti analizne metode.
Kaj je natančnost?
Natančnost opisuje, kako blizu skupaj so ponovljeni rezultati meritev.
Metoda lahko daje zelo natančne rezultate, ki kljub temu sistematično odstopajo.
Zato sta pomembni tako natančnost kot točnost.
Kaj je specifičnost?
Specifičnost opisuje, ali lahko analitska metoda želeno komponento dovolj dobro razlikuje od drugih komponent.
Primeri so:
- nečistote;
- razgradni produkti;
- komponente formulacije;
- protiioni.
Ustrezen referenčni standard lahko pomaga pri identifikaciji glavnega vrha.
Ali lahko dva laboratorija dobita različne rezultate?
Da.
Razlike lahko nastanejo zaradi:
- referenčni standard;
- analitska metoda;
- priprava vzorca;
- oprema;
- kalibracija;
- obdelava podatkov;
- merilna negotovost.
Uporaba dobro karakteriziranih standardov in validiranih metod lahko izboljša primerljivost.
Ali je komercialni peptid samodejno referenčni standard?
Ne.
Komercialni peptid je lahko primeren kot raziskovalni material, vendar ni samodejno kvalificiran referenčni standard.
Za uporabo kot standard mora biti jasno:
- identiteta;
- vsebnost peptida;
- čistost;
- vsebnost vode;
- vsebnost protijonov;
- stabilnost pri shranjevanju;
- dokumentacija.
Zahteve so odvisne od analitskega namena.
Uradni farmakopejski referenčni standardi
Uradne organizacije zagotavljajo referenčne standarde za posebne kompendialne namene.
Primeri so:
- referenčni standardi USP;
- Referenčni standardi Evropske farmakopeje;
- Mednarodne kemijske referenčne snovi SZO.
Ti standardi so namenjeni uporabam, opisanih v ustreznih uradnih metodah ali dokumentaciji.
Za vsak raziskovalni peptid ne obstaja uradni farmakopejski standard.
Znanstvene omejitve
Referenčni standard izboljša analitsko primerljivost, vendar ne odpravi vseh merilnih izzivov.
Zanesljivost je še vedno odvisna od:
- analitska metoda;
- priprava vzorca;
- instrument;
- kalibracija;
- shranjevanje;
- obdelava podatkov;
- merilna negotovost.
Ustrezni retencijski čas pri HPLC sam po sebi ne dokazuje celotne molekulske identitete.
Ustrezna molekulska masa ne dokazuje samodejno:
- pravilno celotno zaporedje;
- natančna količina peptida;
- odsotnost vseh nečistot.
Zato se uporablja več komplementarnih analitskih tehnik.
Povzetek
Peptidni referenčni standard je dobro karakteriziran material, ki se uporablja kot analitična primerjalna osnova.
Referenčni standardi se lahko uporabljajo za:
- identifikacija;
- primerjava HPLC;
- kalibracija;
- določanje vsebnosti peptida;
- kvantifikacija;
- validacija metode;
- analiza nečistot.
Primarni standard je obsežno karakteriziran.
Sekundarni ali delovni standard se kvalificira glede na ustrezni primarni referenčni standard in se lahko uporablja za rutinske analize.
Za kvantitativne namene je samo HPLC-čistost običajno nezadostna. Oceniti je treba tudi vsebnost peptida, vodo, protiione in druge pomembne komponente.
Zanesljiva analitska primerjava zahteva:
- ustrezen referenčni standard;
- pravilna dodelitev vrednosti;
- sledljivost serije;
- nadzorovano shranjevanje;
- validirana analizna metoda;
- ocena merilne negotovosti.
Uradni viri in znanstvene reference
-
ICH Q2(R2) — Validacija analitskih postopkov
Mednarodna smernica za validacijo analitskih postopkov, vključno s specifičnostjo, točnostjo, natančnostjo, linearnostjo in merilnim območjem. -
USP — Uradni referenčni standardi
USP opisuje referenčne standarde kot obsežno karakterizirane materiale za med drugim raziskovanje identitete, jakosti, čistosti in kakovosti. -
Referenčni standardi Evropske farmakopeje — EDQM
Katalog EDQM vsebuje uradno veljavne referenčne standarde za uporabe, opisane v Evropski farmakopeji. -
WHO — Mednarodne kemijske referenčne snovi
WHO-ICRS se določajo s postopki, ki so usklajeni s smernicami WHO za kemijske referenčne snovi. -
NIST — Metrološka sledljivost
NIST opredeljuje metrološko sledljivost kot dokumentirano, neprekinjeno verigo kalibracij do določenih referenc. -
NIST — Standardni referenčni materiali
NIST razvija in certificira referenčne materiale z dobro opredeljeno sestavo ali lastnostmi za podporo zanesljivim in primerljivim meritvam. -
FDA — Analitski postopki in validacija metod za zdravila in biološka zdravila
Smernice FDA obravnavajo uporabo in kvalifikacijo referenčnih standardov v okviru validacije analitskih metod.
Izjava o omejitvi odgovornosti za raziskovalno uporabo
Raziskovalni peptidi Peptidera so na voljo izključno za Research Use Only (RUO) ter so namenjeni laboratorijskim raziskavam in analitskim uporabam.
Ni namenjeno uživanju pri ljudeh ali živalih, diagnostični uporabi, terapevtski uporabi ali samozdravljenju.
Kategorija:
Znanje o peptidih in nadzor kakovosti
Sorodni izdelki Peptidera:
Raziskovalni peptidi z identifikacijo serije in razpoložljivimi neodvisnimi analitskimi podatki o kakovosti
Sorodni notranji blogi:
- PB-0230 — Čistost peptidov in HPLC
- PB-0231 — Masna spektrometrija pri peptidih
- PB-0233 — Analiza peptidov: čistost v primerjavi z vsebnostjo peptidov
- PB-0238 — Protiioni pri peptidih
- PB-0239 — Analiza aminokislin pri peptidih
- PB-0241 — Nadzor neprekinjene sledljivosti pri analizi peptidov
Predlogi za notranje povezave:
- Povezava do PB-0230 o retencijskem času pri HPLC in kromatografski primerjavi
- Povezava do PB-0231 o LC-MS, molekulski masi in MS/MS
- Povezava do PB-0233 o kvantitativnih analizah peptidov
- Povezava do PB-0238 o protiionih in neto vsebnosti peptidov
- Povezava do PB-0239 o analizi aminokislin in dodelitvi vrednosti
- Povezava do PB-0241 o sledljivosti standardov in vzorcev
- Povezava do strani Peptidera z neodvisnimi analiznimi certifikati
- Povezava do zbirke raziskovalnih peptidov