Aminosyranalys av peptider förklarad
Aminosyraanalys av peptider: sammansättning och kvantifiering förklaras
Peptider består av kedjor av aminosyror. Aminosyrornas ordningsföljd avgör en stor del av en peptids kemiska och strukturella egenskaper.
Vid kvalitetsanalys används ofta tekniker som HPLC och masspektrometri för att bedöma renhet och molekylmassa. En kompletterande analysmetod är aminosyraanalys, ofta förkortad till AAA.
Aminosyraanalys kan användas för att undersöka:
- vilka aminosyror som finns i ett prov;
- hur de uppmätta aminosyraförhållandena överensstämmer med den förväntade sammansättningen;
- hur mycket peptid som finns;
- om aminosyrasammansättningen överensstämmer med den teoretiska peptiden;
- hur den netto peptidhalten kan beräknas.
Metoden fungerar annorlunda än HPLC och masspektrometri. Vid klassisk aminosyraanalys bryts peptidkedjan först ned till enskilda aminosyror. Därefter separeras, detekteras och kvantifieras dessa aminosyror.
Aminosyraanalys kan ge värdefull information, men har också begränsningar. Under nedbrytningen kan vissa aminosyror delvis förändras eller gå förlorade. Därför måste resultaten alltid tolkas utifrån den använda metoden.
Vad är aminosyraanalys?
Aminosyraanalys är en laboratorieteknik som används för att undersöka aminosyrasammansättningen i ett prov.
Vid en klassisk analys utförs vanligtvis följande steg:
- provberedning;
- hydrolys av peptidkedjan;
- frigörande av enskilda aminosyror;
- separation av aminosyrorna;
- detektion och kvantifiering;
- jämförelse med den förväntade sammansättningen.
Resultatet kan anges som:
- mängd per aminosyra;
- molkvot;
- masskoncentration;
- aminosyraprofil;
- beräknad peptidhalt.
Vad är hydrolys?
Hydrolys är en kemisk process där bindningar klyvs med hjälp av vatten.
Vid aminosyraanalys bryts peptidbindningarna ned så att enskilda aminosyror frigörs.
En vanlig metod är sur hydrolys.
Provet exponeras då under en kontrollerad tidsperiod för:
- stark syra;
- förhöjd temperatur;
- kontrollerade förhållanden.
Efter hydrolysen finns den ursprungliga peptidkedjan inte längre kvar som en intakt molekyl.
De frigjorda aminosyrorna kan sedan undersökas separat.
Varför bryts peptidkedjan ned?
En intakt peptid kan innehålla tiotals olika aminosyrarester.
Genom att bryta ned kedjan kan den totala mängden av varje aminosyra mätas.
Anta att en teoretisk peptid innehåller:
- fyra alaninrester;
- två glycinrester;
- tre leucinrester;
- en tyrosinrest.
Efter hydrolys kan man undersöka om de uppmätta förhållandena ungefär överensstämmer med denna teoretiska sammansättning.
Detta stödjer bedömningen av aminosyrasammansättningen.
Vad är skillnaden mellan aminosyrasammansättning och aminosyrasekvens?
Aminosyraanalys mäter främst vilka aminosyror som finns och i vilken mängd.
Metoden fastställer inte automatiskt den exakta ordningsföljden.
Två olika peptider kan ha samma aminosyrasammansättning men en annan ordningsföljd.
Till exempel:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Båda innehåller:
- en alanin;
- en glycinmolekyl;
- en leucin.
Trots detta är sekvensen annorlunda.
För sekvensanalys krävs andra tekniker, såsom:
- tandem-masspektrometri;
- fragmentanalys;
- specifika sekvenseringsmetoder.
Kan aminosyraanalys bekräfta identiteten?
Aminosyraanalys kan stödja den förväntade sammansättningen.
När den uppmätta aminosyraprofilen avviker kraftigt från den teoretiska sammansättningen kan detta motivera ytterligare undersökning.
En överensstämmande profil bevisar dock inte självständigt att den exakta aminosyrasekvensen är korrekt.
För en bredare identitetsbedömning kan följande kombineras:
- molekylmassa;
- LC-MS;
- MS/MS;
- aminosyraanalys;
- kromatografiska data.
Hur separeras aminosyror?
Efter hydrolys innehåller provet en blandning av fria aminosyror.
Dessa måste separeras analytiskt från varandra.
Möjliga tekniker är:
- jonbyteskromatografi;
- HPLC;
- UPLC;
- kapillärelektrofores.
Den valda tekniken beror på:
- önskad känslighet;
- laboratoriemetod;
- provtyp;
- nödvändig noggrannhet.
Vad är derivatisering?
Många aminosyror har begränsad detekterbarhet utan ytterligare behandling.
Därför kan de kemiskt kopplas till en detekterbar grupp.
Detta kallas derivatisering.
Derivatisering kan ske:
- före kromatografisk separation;
- efter kromatografisk separation.
De bildade derivaten kan mätas bättre med exempelvis:
- UV-detektion;
- fluorescensdetektion;
- masspektrometri.
Prekolonnderivatisering
Vid prekolonnderivatisering märks aminosyrorna före den kromatografiska separationen.
Därefter separeras de bildade derivaten med hjälp av en kolonn.
Möjliga fördelar är:
- hög känslighet;
- lämplig fluorescensdetektion;
- analys av flera aminosyror.
Reaktionen måste ske reproducerbart.
Ofullständig derivatisering kan påverka kvantifieringen.
Postkolonnderivatisering
Vid postkolonnderivatisering separeras aminosyrorna först.
Efter kolonnen reagerar de med ett detektionsreagens.
Ett känt exempel är analys med ninhydrin.
De bildade reaktionsprodukterna kan sedan mätas optiskt.
Hur bestäms mängden aminosyra?
För kvantifiering används referensstandarder.
Standardlösningar innehåller kända mängder aminosyror.
Dessa mäts för att fastställa ett samband mellan:
- koncentration;
- detektorsignal.
Därefter mäts det okända provet.
Med hjälp av kalibreringsdata kan mängden av varje aminosyra beräknas.
Vad är en intern standard?
En intern standard är ett känt ämne som tillsätts i prover och kalibreringslösningar.
Denna kan bidra till att korrigera för variation under:
- provberedning;
- injektion;
- derivatisering;
- analys.
Den interna standarden måste kunna särskiljas analytiskt från de undersökta aminosyrorna.
Hur kan aminosyraanalys bestämma peptidhalten?
När aminosyrasammansättningen hos en peptid är känd kan utvalda aminosyror användas för att beräkna mängden peptid.
Anta att varje peptidkedja innehåller exakt fyra alaninrester.
När den totala mängden alanin mäts kan man uppskatta hur många peptidkedjor som fanns.
Beräkningen tar hänsyn till:
- antal rester per peptid;
- molekylmassa;
- uppmätt mängd aminosyra;
- analysmetod.
Detta kan användas för en kvantitativ peptidanalys.
Varför används inte alltid alla aminosyror?
Alla aminosyror lämpar sig inte lika väl för kvantifiering.
Vissa aminosyror kan under hydrolys:
- brytas ned delvis;
- förändras kemiskt;
- frigöras ofullständigt;
- svåra att mäta tillförlitligt.
Därför väljs ofta stabila aminosyror.
Valet beror på peptidsekvensen och analysmetoden.
Vilka aminosyror kan förändras under hydrolys?
Sur hydrolys kan ha olika effekter.
Tryptofan
Tryptofan kan till stor del brytas ned under standardiserad sur hydrolys.
Därför behövs anpassade metoder när tryptofan ska mätas specifikt.
Asparagin
Asparagin kan omvandlas till aspartat under hydrolys.
Därför rapporteras asparagin och aspartat inte alltid separat vid klassisk analys.
Glutamin
Glutamin kan omvandlas till glutamat.
Därför kan glutamin och glutamat visas tillsammans.
Serin
Serin kan delvis gå förlorat under långvarig hydrolys.
Treonin
Även treonin kan delvis brytas ned.
Cystein
Cystein kan genomgå oxidativa förändringar.
För tillförlitlig analys kan föregående oxidation eller en anpassad metod behövas.
Varför är hydrolystiden viktig?
Peptidbindningarna måste brytas ned tillräckligt.
För kort hydrolys kan leda till:
- ofullständig nedbrytning;
- för låga uppmätta aminosyravärden.
För lång hydrolys kan leda till:
- ytterligare nedbrytning av känsliga aminosyror;
- mätförlust.
Därför kontrolleras hydrolystid och temperatur.
Ibland används flera hydrolystider för att undersöka förlust eller ofullständig nedbrytning.
Vad är ett molärt förhållande?
Ett molärt förhållande beskriver de relativa antalen aminosyror.
Anta att en peptid teoretiskt innehåller:
- två alaninmolekyler;
- en glycinmolekyl;
- tre leucinmolekyler.
Det teoretiska molära förhållandet är:
2 : 1 : 3
Efter analys kan uppmätta värden normaliseras.
När förhållandet ligger nära det teoretiska värdet stödjer detta den förväntade aminosyrasammansättningen.
Små avvikelser kan uppstå på grund av:
- mätosäkerhet;
- hydrolysförlust;
- derivatisering;
- integrering av kromatografiska toppar.
Vad innebär normalisering?
Vid normalisering omvandlas uppmätta aminosyravärden till relativa förhållanden.
En lämplig aminosyra kan användas som referens.
Därigenom kan den uppmätta profilen jämföras med den teoretiska sammansättningen.
Normalisering är användbar för sammansättningsanalys, men ger inte automatiskt den absoluta peptidmängden.
Aminosyranalys jämfört med HPLC-renhet
HPLC-renhet och aminosyranalys mäter olika egenskaper.
HPLC-renhet undersöker vanligtvis:
- kromatografisk huvudtopp;
- relativ mängd av sidotoppar.
Aminosyranalys undersöker:
- aminosyrasammansättning;
- mängden av utvalda aminosyror;
- möjlig peptidkvantifiering.
En hög HPLC-renhet bevisar inte automatiskt att aminosyrasammansättningen är korrekt.
En lämplig aminosyrasammansättning bevisar inte automatiskt att peptidrelaterade föroreningar saknas.
Teknikerna kompletterar varandra.
Aminosyranalys jämfört med masspektrometri
Masspektrometri undersöker molekylers massa-laddningsförhållande.
En intakt massmätning kan stödja att den molekylära massan överensstämmer med det teoretiska värdet.
Aminosyranalys undersöker mängden och förhållandet mellan aminosyror efter hydrolys.
Båda teknikerna har olika styrkor.
En kombination kan ge mer information om:
- identitet;
- sammansättning;
- peptidhalt.
Aminosyranalys jämfört med peptidanalys
Aminosyranalys kan själv användas som analysmetod.
En peptidanalys beskriver målet:
bestämma mängden peptid.
Aminosyranalys är en av de tekniker som kan användas för att uppnå detta mål.
Andra möjliga analysmetoder är:
- kvantitativ HPLC;
- UV-spektrofotometri;
- LC-MS-kvantifiering;
- massbalans.
Vilken inverkan har mothalter?
Mothalter som:
- acetat;
- klorid;
- TFA;
bidrar till den totala massan av frystorkat material.
Vid aminosyranalys undersöks främst peptidens aminosyrakomponenter.
Därigenom kan metoden hjälpa till att skilja mellan:
- total materialmassa;
- verklig mängd peptid.
För en fullständig massbalans kan ytterligare analyser behövas.
Vilken inverkan har kvarvarande fukt?
Kvarvarande fukt bidrar till den totala vikten, men inte till aminosyrasammansättningen.
När nettomängden peptid beräknas kan fuktanalys ge ytterligare information.
En omfattande massbalans kan bestå av:
- peptidhalt;
- vattenhalt;
- mothaltsinnehåll;
- övriga komponenter.
Kan aminosyranalys påvisa föroreningar?
Vissa avvikande aminosyrasignaler kan tyda på oväntade komponenter.
Metoden är dock inte utformad för att upptäcka alla möjliga föroreningar.
Andra tekniker kan behövas för:
- organiska föroreningar;
- restlösningsmedel;
- metaller;
- mikrobiologisk kontaminering;
- endotoxiner.
Vad kan anges i ett COA?
Ett analyscertifikat kan innehålla information som:
- test: aminosyranalys;
- analysmetod;
- uppmätta aminosyraförhållanden;
- teoretiska förhållanden;
- beräknad peptidhalt;
- testdatum;
- batchnummer.
Alla COA innehåller inte aminosyranalys.
När endast HPLC och MS har utförts kan ingen fullständig kvantifiering av aminosyror härledas från detta.
Varför är batchkoppling viktig?
En aminosyranalys måste kopplas till den undersökta batchen.
Viktiga uppgifter är:
- lotnummer;
- produktnamn;
- analysdatum;
- laboratorium;
- analysmetod.
En analyserapport utan tydlig koppling till batchen har mindre värde för spårbarheten.
Vad innebär mätosäkerhet?
Varje kvantitativ analys innehåller mätosäkerhet.
Vid aminosyranalys kan variationskällor vara:
- provberedning;
- hydrolys;
- aminosyraförlust;
- derivatisering;
- kalibrering;
- kromatografisk separation;
- toppintegrering.
Därför bör resultaten inte betraktas som absolut felfria.
Varför är metodvalidering viktigt?
En metod ska vara lämplig för det avsedda ändamålet.
Vid kvantitativ aminosyraanalys kan relevanta valideringsegenskaper vara:
- noggrannhet;
- precision;
- linjäritet;
- specificitet;
- mätområde;
- robusthet;
- repeterbarhet.
En metod som är lämplig för en kvalitativ aminosyraprofil är inte automatiskt tillräcklig för exakt kvantifiering av peptid.
Vetenskapliga begränsningar
Aminosyraanalys har viktiga begränsningar.
Metoden fastställer inte självständigt:
- exakt aminosyrasekvens;
- molekylmassa;
- HPLC-renhet;
- tredimensionell struktur;
- biologisk aktivitet;
- sterilitet;
- endotoxinhalten.
Dessutom kan vissa aminosyror förändras under hydrolys.
För en bred kvalitetsbedömning måste flera analystekniker kombineras.
Sammanfattning
Aminosyraanalys undersöker sammansättningen och mängden aminosyror i en peptid.
Vid klassisk analys bryts peptidkedjan först ned genom hydrolys.
Därefter kvantifieras aminosyrorna:
- separeras;
- detekteras;
- kvantifieras;
- jämfört med den teoretiska sammansättningen.
Aminosyraanalys kan användas för:
- kontroll av aminosyrasammansättning;
- bedömning av molkvoter;
- kvantifiering av peptidhalt;
- stöd för identitet.
Metoden har begränsningar eftersom vissa aminosyror kan förändras under hydrolys.
Därför kombineras aminosyraanalys helst med:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- peptidassay;
- restfuktsanalys;
- motjonanalys.
Forskningsfriskrivning
Peptideras forskningspeptider erbjuds uteslutande för Research Use Only (RUO) och är avsedda för laboratorieforskning och analytiska tillämpningar.
Inte avsedd för human- eller djurkonsumtion, diagnostisk användning, terapeutisk tillämpning eller självadministrering.
Peptidkunskap & kvalitetskontroll
Relaterade Peptidera-produkter:
Frystorkade forskningspeptider med batchidentifiering och tillgängliga analytiska kvalitetsdata
Relaterade interna bloggar:
- PB-0230 — Peptidrenhet och HPLC
- PB-0231 — Masspektrometri av peptider
- PB-0233 — Peptidassay: renhet kontra peptidhalt
- PB-0234 — Restfukt i frystorkade peptider
- PB-0238 — Motjoner i peptider
Förslag på interna länkar:
- Länk till PB-0233 om aminosyraanalys som peptidassay
- Länk till PB-0230 om skillnaden mot HPLC-renhet
- Länk till PB-0231 om molekylmassa och sekvensanalys
- Länk till PB-0234 om restfukt och nettomängd peptid
- Länk till PB-0238 om motjoner och massbalans
- Länk till Peptideras sida med analyscertifikat
- Länk till samlingen av forskningspeptider