Masspektrometri för peptider förklarad
Masspektrometri av peptider: hur undersöks den molekylära identiteten?
Vid kvalitetskontroll av forskningspeptider kombineras ofta flera analystekniker. HPLC kan ge information om den kromatografiska renheten, men en hög huvudtopp bevisar inte automatiskt att rätt peptid finns närvarande.
För att undersöka den molekylära identiteten ytterligare används ofta masspektrometri.
Masspektrometri, vanligtvis förkortat MS, är en analytisk teknik som mäter massa-laddningsförhållandet hos joniserade molekyler. Vid peptidanalys kan den uppmätta molekylmassan jämföras med den teoretiskt förväntade massan för aminosyrasekvensen.
När dessa värden överensstämmer stödjer det identifieringen av den undersökta peptiden. Masspektrometri ger dock inte heller självständigt en fullständig bild av kvaliteten.
I den här bloggen går vi igenom hur masspektrometri fungerar, varför peptider kan ge upphov till flera massignaler och hur MS-resultat tolkas tillsammans med HPLC och andra analysmetoder.
Vad är masspektrometri?
Masspektrometri är en analysteknik där molekyler omvandlas till laddade partiklar, så kallade joner.
Dessa joner separeras och mäts sedan baserat på deras massa-laddningsförhållande.
Detta förhållande anges som:
m/z
Här står:
- m för massa;
- z för elektrisk laddning.
En masspektrometer mäter alltså inte alltid den fullständiga molekylmassan direkt. Instrumentet mäter förhållandet mellan massa och laddning.
Hos större molekyler, inklusive många peptider, kan flera laddningar uppstå. Därför kan samma peptid synas på olika platser i masspektrumet.
Varför används masspektrometri vid peptidanalys?
En peptid består av en specifik sekvens av aminosyror.
Varje aminosyrakombination har en teoretiskt beräkningsbar molekylmassa.
Masspektrometri kan användas för att undersöka om den uppmätta massan överensstämmer med detta teoretiska värde.
MS-analys kan bidra till:
- bekräftelse av molekylär identitet;
- jämförelse med den teoretiska molekylmassan;
- detektering av vissa kemiska modifieringar;
- analys av nedbrytningsprodukter;
- undersökning av peptidvarianter;
- jämförelse mellan produktionsbatcher.
En motsvarande massa stödjer peptidens identitet.
Resultatet måste dock alltid bedömas i kombination med analysmetoden och andra kvalitetsdata.
Vad är den teoretiska molekylmassan?
Den teoretiska molekylmassan beräknas utifrån:
- aminosyrasekvensen;
- antal aminosyror;
- eventuella kemiska modifieringar;
- den molekylära formen;
- specifika ändgrupper.
När aminosyror tillsammans bildar en peptidkedja uppstår peptidbindningar.
När varje peptidbindning bildas avspjälkas en vattenmolekyl. Därför är massan hos en fullständig peptid inte helt enkelt summan av alla enskilda aminosyror.
Även modifieringar kan påverka massan.
Exempel är:
- amidering;
- acetylering;
- fosforylering;
- oxidation;
- tillsats av fettsyrakedjor;
- bildning av disulfidbryggor.
Den teoretiska massan måste därför beräknas utifrån den exakta molekylstrukturen.
Vad betyder molekylvikt?
Termerna molekylmassa och molekylvikt används ofta omväxlande.
I laboratorierapporter anges värdet vanligtvis i:
- dalton, förkortat Da;
- kilodalton, förkortat kDa.
En dalton motsvarar ungefär massan hos en väteatom.
En peptid med en molekylmassa på 3 000 Da har alltså en massa på ungefär 3 kDa.
Peptidernas molekylmassa kan variera kraftigt beroende på:
- kedjelängd;
- aminosyrasammansättning;
- kemiska modifieringar.
Hur fungerar en masspektrometer?
En masspektrometer består vanligtvis av flera delar.
1. Provintroduktion
Peptiden förbereds först och förs in i instrumentet.
Provberedningen kan påverka:
- signalstyrka;
- detekterbarhet;
- bildning av joner;
- bakgrundssignaler.
2. Jonisering
Molekylerna laddas elektriskt.
Vanliga tekniker för peptidanalys är:
- electrospray ionization;
- matrix-assisted laser desorption/ionization.
3. Massanalys
De bildade jonerna separeras baserat på deras massa-till-laddningsförhållande.
4. Detektion
Detektorn registrerar jonerna.
5. Databearbetning
De uppmätta signalerna omvandlas till ett masspektrum.
Detta spektrum innehåller toppar som motsvarar detekterade joner.
Vad är electrospray ionization?
Electrospray ionization, förkortat ESI, är en vanlig joniseringsteknik för peptider.
Under ESI leds ett flytande prov genom en fin öppning samtidigt som en elektrisk spänning appliceras.
Detta leder till att elektriskt laddade droppar bildas.
När lösningsmedlet avdunstar återstår laddade molekyler.
Ett viktigt kännetecken för ESI är att större molekyler kan få flera elektriska laddningar.
En peptid kan till exempel förekomma som:
- [M+H]⁺;
- [M+2H]²⁺;
- [M+3H]³⁺.
Här står M för peptidens molekylmassa.
Flera laddningar ger olika m/z-signaler för samma molekyl.
Varför har en peptid flera toppar?
När en peptid tar upp flera protoner uppstår olika laddningsformer.
Anta att en peptid har en molekylmassa på ungefär 3 000 Da.
Möjliga signaler är då ungefär:
- en positiv laddning: m/z omkring 3.001;
- två positiva laddningar: m/z omkring 1.501;
- tre positiva laddningar: m/z omkring 1.001.
Dessa signaler kan alla tillhöra samma peptid.
Programvaran kan använda denna laddningsfördelning för att beräkna den ursprungliga molekylmassan.
Denna process kallas dekonvolution.
Vad är ett dekonvolverat masspektrum?
En rå ESI-mätning kan innehålla flera laddningstoppar.
Det kan göra tolkningen komplex.
Med dekonvolutionsprogramvara omvandlas de olika laddningsformerna till en uppskattad molekylmassa.
Det dekonvolverade spektrumet kan därför enklare jämföras med:
- den teoretiska massan;
- en referensstandard;
- produktspecifikationer.
Beräkningens kvalitet beror på:
- signalstyrka;
- upplösning;
- bakgrundsbrus;
- programvaruinställningar;
- förekomst av överlappande komponenter.
Vad är MALDI?
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, förkortat MALDI, är en annan joniseringsteknik.
Peptiden blandas med ett matrismaterial och appliceras på en provplatta.
En laser aktiverar matrisen, vilket gör att peptidjoner bildas.
MALDI producerar ofta huvudsakligen enkelladdade joner.
Därför kan spektrumet se enklare ut än ett ESI-spektrum.
MALDI kombineras ofta med en time-of-flight-massanalysator.
Denna kombination kallas:
MALDI-TOF
Vad är time-of-flight?
I en time-of-flight-massanalysator accelereras joner av ett elektriskt fält.
Därefter rör de sig genom ett mätrör.
Joner med lägre massa-till-laddningsförhållande når vanligtvis detektorn snabbare än joner med högre förhållande.
Flygtiden används för att beräkna m/z-värdet.
TOF-system kan användas för:
- peptididentifiering;
- massbestämning;
- jämförelse av molekylära varianter.
Den slutliga noggrannheten beror på kalibrering, instrumentinställningar och provberedning.
Vad är LC-MS?
Liquid chromatography-mass spectrometry, förkortat LC-MS, kombinerar vätskekromatografi med masspektrometri.
Komponenterna separeras först kromatografiskt.
Därefter analyseras de enskilda signalerna av masspektrometern.
LC-MS kan kombinera information om:
- retentionstid;
- kromatografisk profil;
- molekylmassa;
- möjliga föroreningar;
- nedbrytningsprodukter.
Därför kan LC-MS ge större insikt än en separat HPLC- eller MS-analys.
Vad är skillnaden mellan HPLC och masspektrometri?
HPLC och masspektrometri besvarar olika analytiska frågor.
HPLC
HPLC kan ge information om:
- kromatografisk renhet;
- relativ mängd av detekterade komponenter;
- retentionstider;
- förändringen i den kromatografiska profilen.
Masspektrometri
Masspektrometri kan ge information om:
- molekylmassa;
- möjlig identitet;
- kemiska modifieringar;
- vissa nedbrytningsprodukter.
En förenklad jämförelse:
| Analytisk fråga | HPLC | Masspektrometri |
|---|---|---|
| Hur många kromatografiska komponenter är synliga? | Ja | Begränsat |
| Vad är den relativa huvudtoppen? | Ja | Inte primärt |
| Överensstämmer massan med den förväntade peptiden? | Nej | Ja |
| Kan identiteten styrkas? | Begränsat | Ja |
| Bestäms den exakta mängden i vialen? | Inte automatiskt | Inte automatiskt |
| Undersöks sterilitet? | Nej | Nej |
Därför kombineras ofta båda teknikerna.
Kan samma molekylmassa förekomma hos olika peptider?
Ja.
Olika aminosyrasekvenser kan ha samma eller nästan samma totala massa.
Dessa kallas ibland isobara strukturer.
En överensstämmande massa bevisar därför inte alltid att hela aminosyrasekvensen är korrekt.
För mer omfattande identifiering kan ytterligare tekniker behövas, till exempel:
- tandemmasspektrometri;
- fragmenteringsanalys;
- aminosyranalys;
- sekvensanalys;
- jämförelse med en referensstandard.
Den analysmetod som behövs beror på vilken säkerhetsnivå som önskas.
Vad är tandemmasspektrometri?
Tandemmasspektrometri skrivs vanligtvis som:
MS/MS
Under MS/MS fragmenteras en utvald peptidjon ytterligare.
De bildade fragmenten mäts sedan på nytt.
Fragmenteringsmönstret kan ge information om:
- aminosyrasekvens;
- modifikationernas lokalisering;
- peptididentitet;
- struktur hos nedbrytningsprodukter.
MS/MS kan därför ge mer strukturell information än enbart den intakta molekylmassan.
Vad är peptidfragment?
När en peptidkedja bryts på specifika ställen under MS/MS bildas fragmentjoner.
Vanliga fragmenttyper är:
- b-joner;
- y-joner.
Massorna hos dessa fragment kan användas för att rekonstruera delar av aminosyrasekvensen.
Tolkningen kan vara komplex.
Alla peptider fragmenteras inte på samma sätt.
Faktorer som kan påverka är:
- aminosyrasammansättning;
- elektrisk laddning;
- peptidstorlek;
- fragmenteringsmetod;
- kemiska modifieringar.
Kan masspektrometri detektera oxidation?
Vissa oxidativa förändringar orsakar en mätbar massförändring.
Tillsats av en syreatom leder till exempel ofta till en massökning på cirka 16 Da.
Därigenom kan masspektrometri bidra till att identifiera vissa oxidationsprodukter.
Detektionen beror på:
- koncentration;
- instrumentupplösning;
- analysmetod;
- separation av komponenter.
Alla oxidativa förändringar kan inte lokaliseras fullständigt enbart utifrån en enda massignal.
Ytterligare fragmenteringsanalys kan behövas för detta.
Kan masspektrometri bestämma mängden peptid?
Inte automatiskt.
Intensiteten hos en massignal påverkas av:
- joniseringseffektivitet;
- molekylära egenskaper;
- lösningsmedel;
- instrumentinställningar;
- förekomst av andra komponenter.
En dubbelt så stark signal betyder därför inte automatiskt att det finns dubbelt så mycket peptid.
För tillförlitlig kvantifiering krävs validerade metoder och lämpliga standarder.
Möjliga tekniker är:
- kvantitativ LC-MS;
- interna standarder;
- isotopmärkta referenser;
- kalibrerade HPLC-analyser.
Kan masspektrometri påvisa sterilitet?
Nej.
Masspektrometri för peptididentitet är inte ett sterilitetstest.
Resultatet ger ingen direkt information om:
- bakterier;
- svampar;
- mikrobiell tillväxt;
- produktens sterilitet.
Sterilitet kräver specifika mikrobiologiska testmetoder.
Endotoxiner bestäms inte heller automatiskt vid en standardiserad peptid-MS-analys.
Kan masspektrometri mäta endotoxiner?
Inte genom en standardiserad identitetsanalys.
Endotoxiner är komplexa bakteriekomponenter.
För endotoxinanalys används specifika metoder, till exempel:
- Limulus amebocytlysat-test;
- rekombinanta faktor C-metoder.
Ett korrekt masspektrum för en peptid bevisar därför inte att materialet har en låg endotoxinhalt.
Identitet, renhet, sterilitet och endotoxiner är separata kvalitetsparametrar.
Varför kan laboratorieresultat skilja sig åt?
Olika laboratorier kan rapportera något avvikande massvärden.
Möjliga orsaker är:
- instrumenttyp;
- kalibrering;
- joniseringsmetod;
- provberedning;
- saltaddukter;
- använd programvara;
- upplösning;
- tolkningsmetod.
Små skillnader innebär inte automatiskt att ett resultat är felaktigt.
Det uppmätta värdet måste bedömas inom ramen för:
- instrumentets noggrannhet;
- förväntad molekylform;
- använd analysmetod.
Vad är addukter?
Under masspektrometri kan peptidjoner binda till andra laddade partiklar.
Exempel är:
- natrium;
- kalium;
- ammonium.
Därför kan ytterligare toppar uppstå.
En natriumaddukt har till exempel en annan massa än en enkelt protonerad peptidjon.
Addukter innebär inte automatiskt att en annan peptid förekommer.
Tolkningen kräver kunskap om:
- provberedning;
- använda buffertar;
- förväntade jonformer.
Vilken information ska ingå i en MS-rapport?
En professionell analyserapport kan bland annat innehålla:
- peptidens namn;
- batch- eller lotnummer;
- teoretisk molekylmassa;
- uppmätt molekylmassa;
- joniseringsmetod;
- typ av masspektrometer;
- masspektrum;
- analysdatum;
- laboratoriets namn.
Vid en mer omfattande analys kan även följande anges:
- mätområde;
- upplösning;
- massnoggrannhet;
- fragmenteringsdata;
- använd programvara.
Den rapportering som krävs beror på forskningsmålet.
Masspektrometri och batchkontroll
Varje produktionsbatch kan undersökas separat.
Batchspecifik MS-analys stöder:
- identitetskontroll;
- jämförelse mellan batcher;
- spårbarhet;
- utredning av avvikelser.
Batchnumret på analysrapporten måste överensstämma med identifieringen på vialen.
Ett masspektrometriskt resultat utan tydlig koppling till en batch har ett begränsat värde för spårbarheten.
Vetenskapliga begränsningar
Masspektrometri är en kraftfull analysteknik, men inte en fullständig kvalitetsbedömning.
En överensstämmande molekylmassa bevisar inte automatiskt:
- fullständig aminosyrasekvens;
- hög kromatografisk renhet;
- korrekt mängd peptid;
- sterilitet;
- lågt endotoxininnehåll;
- biologisk aktivitet;
- långtidsstabilitet.
För en bredare bedömning kan flera metoder behövas:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- kvantitativ analys;
- stabilitetsstudier;
- fuktanalys;
- ytterligare produktspecifika tester.
Resultaten måste tolkas tillsammans.
Sammanfattning
Masspektrometri används för att undersöka forskningspeptidernas molekylmassa.
Tekniken mäter förhållandet mellan massa och laddning hos joniserade molekyler.
Vid peptidanalys kan den uppmätta massan jämföras med den teoretiskt förväntade massan.
En överensstämmelse stöder den molekylära identifieringen.
Viktiga analystekniker är:
- ESI-MS;
- MALDI-TOF;
- LC-MS;
- MS/MS.
Masspektrometri ger dock inte automatiskt information om:
- exakt mängd;
- kromatografisk renhet;
- sterilitet;
- endotoxiner;
- biologisk aktivitet.
Därför kombineras MS ofta med HPLC och kompletterande kvalitetsanalyser.
Forskningsfriskrivning
Peptideras forskningspeptider erbjuds uteslutande för Research Use Only (RUO) och är avsedda för laboratorieforskning och analytiska tillämpningar.
Inte avsedda för mänsklig eller animalisk konsumtion, diagnostisk användning, terapeutisk tillämpning eller självadministrering.
Kategori:
Peptidkunskap & kvalitetskontroll
Relaterade Peptidera-produkter:
Frystorkade forskningspeptider med batchidentifiering och tillgängliga analytiska kvalitetsdata
Relaterade interna bloggar:
- PB-0227 — Frystorkade peptider och lyofilisering
- PB-0228 — Peptidvialer och förpackningsintegritet
- PB-0229 — Batchnummer och spårbarhet
- PB-0230 — Peptidrenhet och HPLC
- Vad är ett Certificate of Analysis?
Förslag på interna länkar:
- Länk till PB-0230 om skillnaden mellan HPLC och MS
- Länk till PB-0229 om batchspecifik analys
- Länk till COA-sidan med masspektrometriska testresultat
- Länk till kollektionen med forskningspeptider
- Länk till sidan om oberoende laboratorieanalys