Peptidreferensstandarden förklarad
Peptidreferensstandarder: varför analytisk jämförelse är viktig
Vid kvalitetsanalys av forskningspeptider används ofta tekniker som:
- HPLC;
- LC-MS;
- peptidanalys;
- aminosyranalys;
- UV-spektrofotometri.
Dessa instrument genererar mätdata, men en detektorsignal eller en kromatografisk topp har inte automatiskt en exakt betydelse.
För att tillförlitligt identifiera eller kvantifiera ett okänt prov kan det jämföras med ett material vars relevanta egenskaper redan har fastställts noggrant.
Ett sådant material kallas referensstandard.
En välkarakteriserad peptidreferensstandard kan användas för:
- identifiering;
- jämförelse av retentionstider;
- kvantifiering;
- kalibrering;
- utvärdering av HPLC-metoder;
- undersökning av föroreningar;
- analys av nedbrytningsprodukter;
- stöd för mätspårbarhet.
Kvaliteten på ett analytiskt resultat beror därför inte enbart på laboratorieinstrumentet. Även identiteten, renheten, peptidhalten, lagringen och dokumentationen för den använda referensstandarden är viktiga.
En referensstandard är dessutom inte automatiskt detsamma som ett godtyckligt prov med en hög HPLC-halt. För kvantitativ användning måste det vara tydligt hur mycket faktisk peptid som finns och vilka icke-peptidkomponenter som bidrar till den totala massan.
I den här bloggen går vi igenom vad peptidreferensstandarder är, hur primära och sekundära standarder skiljer sig åt och varför analytisk jämförelse är viktig för tillförlitlig peptidanalys.
Vad är en peptidreferensstandard?
En peptidreferensstandard är ett noggrant karakteriserat material som används som jämförelsegrund vid laboratorieanalys.
Beroende på forskningens syfte kan egenskaper som följande ha fastställts:
- aminosyrasekvens;
- molekylmassa;
- identitet;
- HPLC-renhet;
- peptidinnehåll;
- vattenhalt;
- motjonshalt;
- förekomst av relevanta föroreningar;
- lagringsstabilitet.
Standarden kan sedan användas för analytisk jämförelse med ett okänt prov.
Vilken karakterisering som krävs beror på användningsområdet.
En standard för identifiering behöver inte alltid uppfylla exakt samma krav som en standard för kvantitativ analys.
Varför behövs analytisk jämförelse?
Ett laboratorieinstrument mäter en fysikalisk eller kemisk signal.
Exempel är:
- UV-absorption;
- fluorescens;
- kromatografisk topparea;
- mass-till-laddningsförhållande;
- jonintensitet.
En signal motsvarar inte automatiskt en exakt mängd peptid.
För detta behövs ett tillförlitligt samband mellan:
- känd mängd;
- uppmätt signal;
- okänt prov.
En referensstandard kan hjälpa till att fastställa detta samband.
Ett enkelt exempel
Anta att ett laboratorium vill bestämma mängden av en peptid med kvantitativ HPLC.
Laboratoriet bereder olika lösningar av en karakteriserad referensstandard:
- 0,1 mg/ml;
- 0,25 mg/ml;
- 0,5 mg/ml;
- 0,75 mg/ml;
- 1,0 mg/ml.
Varje lösning analyseras.
De uppmätta toppareorna plottas mot de kända koncentrationerna.
Därigenom erhålls en kalibreringskurva.
Därefter mäts det okända provet.
Koncentrationen kan beräknas genom att jämföra provets signal med kalibreringskurvan.
Tillförlitligheten hos denna beräkning beror bland annat på:
- referensstandardens kvalitet;
- korrekt koncentrationsberäkning;
- noggrann vägning;
- noggrann pipettering;
- metodens linjäritet;
- lösningarnas stabilitet.
Vad är en primär referensstandard?
En primär referensstandard är ett material vars relevanta egenskaper har fastställts omfattande.
Standarden kan karakteriseras med flera oberoende analystekniker.
Möjliga analyser är:
- HPLC;
- LC-MS;
- aminosyranalys;
- vattenbestämning;
- motjonsanalys;
- NMR;
- elementanalys;
- massbalans.
Syftet är att med hög tillförlitlighet fastställa:
- vilket material som finns;
- hur rent det är;
- hur mycket av den önskade komponenten som finns;
- vilka korrigeringsfaktorer som behövs.
En primär standard kan sedan användas för att kvalificera andra standarder.
Vad är en sekundär referensstandard?
En sekundär referensstandard kallas också:
- arbetsstandard;
- arbetsstandard;
- intern referensstandard.
Denna standard kvalificeras genom jämförelse med en primär eller officiellt erkänd referensstandard.
En sekundär standard kan användas för rutinmässiga laboratorieanalyser.
Möjliga fördelar är:
- större tillgänglighet;
- lägre kostnader;
- bevarande av den primära standarden;
- effektivare rutinanvändning.
Den sekundära standarden måste dock kontrolleras regelbundet och förvaras korrekt.
Varför används inte alltid den primära standarden?
Primära standarder kan:
- vara begränsat tillgängliga;
- vara kostsamma;
- levereras i små mängder;
- vara avsedda för specifika officiella analysmetoder.
Genom att kvalificera en sekundär standard mot en primär standard kan rutinanalyser utföras utan att den primära standarden behöver användas kontinuerligt.
Tillförlitligheten beror på kvalificeringens kvalitet.
Vad innebär kvalificering av en arbetsstandard?
Kvalificering innebär att arbetsstandardens egenskaper systematiskt undersöks och jämförs med en lämplig referens.
Ett kvalificeringsprogram kan bestå av:
- identitetskontroll;
- HPLC-renhet;
- peptidanalys;
- vattenhalt;
- motjonshalt;
- jämförelse av kromatogram;
- jämförelse av masspektra;
- stabilitetsbedömning.
De tester som krävs beror på den avsedda användningen.
Identitet kontra kvantifiering
En referensstandard kan ha flera analytiska funktioner.
Identitetsstandard
En identitetsstandard används för att undersöka om ett okänt prov överensstämmer med den förväntade peptiden.
Möjliga jämförelser är:
- HPLC-retentietid;
- molekylmassa;
- masspektrometrisk profil;
- spektroskopiska egenskaper.
Kvantitativ standard
En kvantitativ standard används för att bestämma mängden peptid.
För detta måste den faktiska peptidhalten vara tillräckligt tillförlitligt känd.
Enbart hög HPLC-renhet är vanligtvis inte tillräckligt för detta.
Varför räcker inte HPLC-renhet?
En peptid kan till exempel ha en HPLC-renhet på 99 %.
Det betyder inte automatiskt att 99 % av den totala massan utgörs av peptiden.
Materialet kan dessutom innehålla:
- vatten;
- acetat;
- klorid;
- TFA;
- salter;
- andra icke-kromatografiskt uppmätta komponenter.
För en kvantitativ standard måste man därför skilja mellan:
- kromatografisk renhet;
- total materialmassa;
- nett peptidhalt.
Vad är det tilldelade värdet?
En referensstandard kan ha ett tilldelat värde.
Detta värde beskriver till exempel:
- peptidinnehåll;
- renhet;
- koncentration;
- potens;
- mängd per förpackning.
Det tilldelade värdet måste baseras på lämpliga analytiska data.
En korrigeringsfaktor kan också anges.
Vad är en korrigeringsfaktor?
En korrigeringsfaktor används för att omvandla den vägda materialmängden till den faktiska peptidmängden.
Anta:
- vägt material: 10,0 mg;
- tilldelad peptidhalt: 85 %;
- faktisk peptidmängd: 8,5 mg.
Om denna korrigering inte tillämpas kan den beräknade koncentrationen överskattas.
Varför är nettomängden peptid viktig?
Nettomängden peptid beskriver andelen faktisk peptid i det undersökta materialet.
Vid beräkningen kan faktorer som följande beaktas:
- restfukt;
- motjoner;
- organiska komponenter;
- oorganiska komponenter.
För kvantitativ analys är detta ofta mer relevant än enbart HPLC-renheten.
Vilken roll spelar aminosyranalys?
Aminosyranalys kan användas för att bestämma peptidhalten.
Peptidkedjan hydrolyseras då till enskilda aminosyror.
Utvalda aminosyror kvantifieras därefter.
När det är känt hur mycket av dessa aminosyror som finns i varje peptidkedja kan mängden peptid beräknas.
Aminosyranalys kan därmed bidra till värdetilldelningen av en referensstandard.
Vilken roll spelar masspektrometri?
Masspektrometri kan bidra till att bekräfta:
- molekylmassa;
- identitet;
- vissa modifieringar;
- nedbrytningsprodukter.
LC-MS kan kombinera kromatografisk separation med massdetektion.
En överensstämmande molekylmassa stöder identiteten, men bevisar inte självständigt:
- exakt peptidmängd;
- fullständig sekvens;
- frånvaro av alla föroreningar.
Därför kombineras ofta flera tekniker.
Vilken roll spelar MS/MS?
Vid tandem-masspektrometri fragmenteras en utvald peptidjon.
Fragmenten kan ge information om aminosyrasekvensen.
MS/MS kan därmed ge ytterligare stöd för:
- sekvensbekräftelse;
- lokalisering av modifieringar;
- identifiering av nedbrytningsprodukter.
Analysförmågan beror på:
- peptidstorlek;
- fragmentering;
- instrumentupplösning;
- databehandling.
Vilken roll spelar HPLC?
HPLC kan användas för:
- jämförelse av retentionstider;
- bedömning av kromatografisk renhet;
- undersökning av sidotoppar;
- kvantitativ analys;
- stabilitetsstudie.
Vid jämförelse måste referens och prov analyseras med samma kontrollerade metod.
Viktiga parametrar är:
- kolumntyp;
- mobil fas;
- temperatur;
- flödeshastighet;
- detekteringsvåglängd.
Vad är en kalibreringskurva?
En kalibreringskurva beskriver sambandet mellan kända koncentrationer och uppmätta detectorsignaler.
En tillförlitlig kalibreringskurva måste bedömas utifrån:
- linjäritet;
- mätområde;
- reproducerbarhet;
- avvikelser;
- lämplighet för analysmetoden.
Den okända koncentrationen beräknas inom det validerade mätområdet.
Extrapolering utanför detta område kan orsaka ytterligare osäkerhet.
Vad är linjäritet?
Linjäritet beskriver i vilken grad den uppmätta signalen förändras proportionellt mot koncentrationen.
När koncentrationen fördubblas förväntas en motsvarande förändring av signalen inom ett linjärt område.
Sambandet behöver inte vara linjärt för varje metod över hela koncentrationsområdet.
Därför undersöks det relevanta mätområdet experimentellt.
Vad innebär analytisk spårbarhet?
Analytisk eller metrologisk spårbarhet beskriver hur ett mätresultat via en dokumenterad jämförelsekedja är kopplat till en erkänd referens.
Viktiga delar är:
- använd standard;
- certifikat;
- tilldelat värde;
- kalibrering;
- analysmetod;
- mätosäkerhet;
- dokumentation.
Spårbarhet stöder jämförbarheten mellan resultat från:
- olika mätdagar;
- laboratorier;
- instrument;
- batcher.
Vad är metrologisk spårbarhet?
Metrologi är vetenskapen om mätning.
Metrologisk spårbarhet kräver en dokumenterad och obruten jämförelsekedja till en specificerad referens. Varje steg bidrar till den totala mätosäkerheten.
För peptidanalys kan den praktiska spårbarheten bland annat bero på:
- referensstandard;
- tilldelat peptidinnehåll;
- kalibrerad våg;
- volymetrisk utrustning;
- analytisk metod.
Vad är mätosäkerhet?
Varje analytisk mätning innehåller osäkerhet.
Möjliga källor är:
- referensstandardens osäkerhet;
- vägning;
- pipettering;
- spädning;
- instrumentvariation;
- kalibrering;
- toppintegrering;
- provberedning.
Mätosäkerhet innebär inte att ett resultat är opålitligt.
Det beskriver den uppskattade spridning inom vilken det verkliga värdet rimligen kan ligga.
Varför måste standarder vara batchspecifika?
Även referensstandarder produceras i batcher.
Olika batcher kan skilja sig åt när det gäller:
- peptidinnehåll;
- vattenhalt;
- motjonshalt;
- renhetsprofil;
- stabilitet.
Därför måste det vara tydligt vilket lotnummer för referensstandarden som har använts.
Vad anges på ett certifikat för en referensstandard?
Ett certifikat kan innehålla information om:
- namn;
- katalognummer;
- lotnummer;
- tilldelat värde;
- avsett användningsområde;
- lagringsförhållanden;
- giltighetsinformation;
- analysmetoder;
- korrigeringsfaktor.
Alla certifikat innehåller inte samma uppgifter.
Standarden ska användas enligt tillhörande instruktioner.
Varför är lagringsförhållanden viktiga?
En referensstandard kan förändras under lagring.
Möjliga processer är:
- oxidation;
- deamidering;
- fuktupptagning;
- aggregering;
- nedbrytning.
Därför kan villkor fastställas för:
- temperatur;
- ljusskydd;
- fuktskydd;
- användning efter öppnande;
- lagringstid.
En standard som har förvarats felaktigt kan orsaka felaktiga jämförelser.
Vad är ett utgångsdatum?
Vissa referensstandarder har ett fastställt utgångsdatum.
Andra standarder använder:
- giltighetskontroll;
- omkvalificeringsdatum;
- aktuell lotstatus.
Laboratoriet måste kontrollera att standarden är lämplig och giltig vid användningstillfället.
Vad är omkvalificering?
Omkvalificering innebär att en referensstandard bedöms på nytt.
Möjliga analyser är:
- HPLC;
- LC-MS;
- peptidanalys;
- vattenhalt;
- jämförelse med en primärstandard.
Omkvalificering kan behövas efter:
- förutbestämd användningstid;
- långvarig lagring;
- förändrat utseende;
- avvikande analysresultat.
Varför är orenhetsstandarder viktiga?
Inte bara den önskade peptiden kan användas som standard.
Även kända föroreningar eller nedbrytningsprodukter kan fungera som referensmaterial.
Exempel är:
- oxidationsprodukter;
- deamiderade varianter;
- fragment;
- deletionssekvenser;
- aggregationsrelaterade komponenter.
Dessa standarder kan hjälpa till att identifiera och kvantifiera sidotoppar.
Vad är nedbrytningsstandarder?
En nedbrytningsstandard representerar en känd nedbrytningsvariant.
Den kan användas för att undersöka:
- var en nedbrytningsprodukt eluerar;
- vilken molekylmassa som finns;
- hur känslig analysmetoden är;
- hur mycket nedbrytningsprodukt som finns.
Inte alla nedbrytningsprodukter finns tillgängliga som rena standarder.
Referensstandarder och metodvalidering
En analysmetod måste kunna visas vara lämplig för det avsedda ändamålet.
ICH Q2(R2) beskriver principer för validering av analytiska metoder. Relevanta egenskaper kan bland annat omfatta specificitet, noggrannhet, precision, linjäritet och mätområde.
Referensstandarder kan användas vid undersökning av:
- noggrannhet;
- specificitet;
- linjäritet;
- kvantitativt intervall;
- metodprestanda.
Vad är noggrannhet?
Noggrannhet beskriver hur nära ett uppmätt resultat ligger ett accepterat referensvärde.
En välkarakteriserad standard kan användas för att undersöka en analysmetods noggrannhet.
Vad är precision?
Precision beskriver hur nära upprepade mätresultat ligger varandra.
En metod kan ge mycket precisa resultat som ändå avviker systematiskt.
Därför är både precision och riktighet viktiga.
Vad är specificitet?
Specificitet beskriver om analysmetoden i tillräcklig grad kan skilja den önskade komponenten från andra komponenter.
Exempel är:
- föroreningar;
- nedbrytningsprodukter;
- formuleringskomponenter;
- motjoner.
En lämplig referensstandard kan hjälpa till att identifiera huvudtoppen.
Kan två laboratorier få olika resultat?
Ja.
Skillnader kan uppstå på grund av:
- referensstandard;
- analysmetod;
- provberedning;
- utrustning;
- kalibrering;
- databearbetning;
- mätosäkerhet.
Användning av välkarakteriserade standarder och validerade metoder kan förbättra jämförbarheten.
Är en kommersiell peptid automatiskt en referensstandard?
Nej.
En kommersiell peptid kan vara lämplig som forskningsmaterial, men är inte automatiskt en kvalificerad referensstandard.
För användning som standard måste följande vara tydligt:
- identitet;
- peptidinnehåll;
- renhet;
- vattenhalt;
- motjonshalt;
- lagringsstabilitet;
- dokumentation.
Kraven beror på det analytiska syftet.
Officiella farmakopéreferensstandarder
Officiella organisationer tillhandahåller referensstandarder för specifika kompediella tillämpningar.
Exempel är:
- USP:s referensstandarder;
- Europeiska farmakopéns referensstandarder;
- WHO:s internationella kemiska referenssubstanser.
Dessa standarder är avsedda för de tillämpningar som beskrivs i de tillhörande officiella metoderna eller dokumentationen.
Det finns inte en officiell farmakopéstandard för alla forskningspeptider.
Vetenskapliga begränsningar
En referensstandard förbättrar den analytiska jämförbarheten, men löser inte alla mätutmaningar.
Tillförlitligheten beror fortfarande på:
- analysmetod;
- provberedning;
- instrument;
- kalibrering;
- lagring;
- databearbetning;
- mätosäkerhet.
En överensstämmande HPLC-retentionstid bevisar inte självständigt den fullständiga molekylära identiteten.
En överensstämmande molekylmassa bevisar inte automatiskt:
- korrekt fullständig sekvens;
- exakt peptidmängd;
- frånvaro av alla föroreningar.
Därför används flera kompletterande analystekniker.
Sammanfattning
En peptidreferensstandard är ett välkarakteriserat material som används som analytisk jämförelsegrund.
Referensstandarder kan användas för:
- identifiering;
- HPLC-jämförelse;
- kalibrering;
- peptidanalys;
- kvantifiering;
- metodvalidering;
- analys av föroreningar.
En primärstandard karakteriseras utförligt.
En sekundär- eller arbetsstandard kvalificeras mot en lämplig primär referens och kan användas för rutinanalys.
För kvantitativa tillämpningar är HPLC-renhet ensam vanligtvis otillräcklig. Även peptidinnehåll, vatten, motjoner och andra relevanta komponenter måste bedömas.
Tillförlitlig analytisk jämförelse kräver:
- lämplig referensstandard;
- korrekt värdetilldelning;
- batchspårbarhet;
- kontrollerad lagring;
- validerad analysmetod;
- bedömning av mätosäkerhet.
Officiella källor och vetenskapliga referenser
-
ICH Q2(R2) — Validation of Analytical Procedures
Internationell riktlinje för validering av analytiska procedurer, inklusive specificitet, noggrannhet, precision, linjäritet och mätområde. -
USP — Official Reference Standards
USP beskriver referensstandarder som omfattande karakteriserade material för bland annat undersökning av identitet, styrka, renhet och kvalitet. -
European Pharmacopoeia Reference Standards — EDQM
EDQM-katalogen innehåller officiellt giltiga referensstandarder för de tillämpningar som beskrivs i Europeiska farmakopén. -
WHO — International Chemical Reference Substances
WHO-ICRS fastställs genom förfaranden som följer WHO:s riktlinjer för kemiska referenssubstanser. -
NIST — Metrological Traceability
NIST beskriver metrologisk spårbarhet som en dokumenterad, obruten kedja av kalibreringar till specificerade referenser. -
NIST — Standard Reference Materials
NIST utvecklar och certifierar referensmaterial med välkarakteriserad sammansättning eller väldefinierade egenskaper för att stödja tillförlitliga och jämförbara mätningar. -
FDA — Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics
FDA:s riktlinjer behandlar användning och kvalificering av referensstandarder inom validering av analytiska metoder.
Forskningsfriskrivning
Peptideras forskningspeptider erbjuds uteslutande för Research Use Only (RUO) och är avsedda för laboratorieforskning och analytiska tillämpningar.
Inte avsedd för konsumtion av människor eller djur, diagnostisk användning, terapeutisk tillämpning eller självadministrering.
Kategori:
Peptidkunskap & kvalitetskontroll
Relaterade Peptidera-produkter:
Forskningspeptider med batchidentifiering och tillgängliga oberoende analytiska kvalitetsdata
Relaterade interna bloggar:
- PB-0230 — Peptidrenhet och HPLC
- PB-0231 — Masspektrometri av peptider
- PB-0233 — Peptidanalys: renhet kontra peptidinnehåll
- PB-0238 — Motjoner hos peptider
- PB-0239 — Aminosyraanalys av peptider
- PB-0241 — Chain of custody vid peptidanalys
Förslag på interna länkar:
- Länk till PB-0230 om HPLC-retentionstid och kromatografisk jämförelse
- Länk till PB-0231 om LC-MS, molekylmassa och MS/MS
- Länk till PB-0233 om kvantitativa peptidanalyser
- Länk till PB-0238 om motjoner och nettomängd peptid
- Länk till PB-0239 om aminosyraanalys och värdetilldelning
- Länk till PB-0241 om spårbarhet för standarder och prover
- Länk till Peptidera-sidan med oberoende analyscertifikat
- Länk till samlingen med forskningspeptider